一种艾滋病毒的全长基因及应用的制作方法

专利名称：：一种艾滋病毒的全长基因及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及艾滋病毒(HIV)的防治领域，更具体涉及一株HIV病毒的全长基因，同时还涉及一株HIV病毒的全长基因在制备治疗或预防艾滋病毒的药物检验中的应用。
背景技术：
：目前，国内外研究者曾测定多株HIV的病毒全长基因序列，范围涉及HIV病毒的多个亚型。不同亚型的病毒在全球具有不同的流行分布，美国和欧洲的流行毒株以B亚型为主，在非洲和印度的流行毒株以C亚型为主，在我国的流行毒株以泰国B以及B/C重组毒株为主，不同亚型病毒在不同地区和人种中的分布提示病毒序列的差异具有表型的意义，许多的研究也表明艾滋病的疫苗具有一定的亚型特异性，不同亚型的毒株之间难以产生有效的交叉免疫保护。这些事实说明不同亚型的病毒具有不同的免疫原性，不同亚型的病毒也可能具有对不同人种的致病能力。另外，各亚型病毒的酶和配体组份对于艾滋病治疗药物的敏感性以及耐药变异特性也不尽相同，为了今后有效控制中国可能出现的耐药毒株，可能需要针对国内流行毒株进行特征性的治疗药物设计。要做好艾滋病的防治工作，需要针对具体的流行病毒株采用有针对性的防御措施，因此分离并研究我国流行毒株的全长序列对于我们后期研发相关疫苗以及探索流行毒株的致病能力具有重要意义。流行于中国的B’亚型的HIV病毒全长基因序列最初见于1998年广西的一株毒株RL42(序列号U71182)，其后是4株来自我国河南地区采供血感染人群的毒株序列(序列号DQ007902，DQ007903，DQ007901，AY180905)。以上流行于我国的5株B，亚型病毒株基因组序列均未作专利申请。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种艾滋病毒(HIV)的全长基因(05CNHB_hp3)，该全长基因分离于中国国内现流行毒株，具有更好的代表性。有利于研究中国国内流行HIV病毒毒株特有病毒学特性及有针对性开发针对于中国国内流行HIV毒株的各种诊断试剂盒及开发相关药物。本发明的另一个目的是在于提供了一种艾滋病毒株的全长基因(05CNHB_hp3)在制备治疗或预防艾滋病毒的药物检验中的应用(一种HIV病毒的全长基因在制备艾滋病疫苗和预防HIV病毒药物的检测中的应用)，以上应用对于中国的艾滋病的预防与控制具有更好的针对性。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施基于以上各方面应用的设想，提供分离并克隆一株中国流行的HIV病毒的全长基因，以便希望以此序列和此序列表达的蛋白为目标开展疫苗和治疗药物研究。并利用该全长基因开展了基于其中gag基因、gpl20基因的疫苗应用以及基于其中逆转录酶基因的抗病毒药物检测的应用，基于该全长基因的实际应用将对中国艾滋病毒防控产生积极影响。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案一株HIV病毒(艾滋病毒)的全长基因，该全长基因命名为05CNHB_hp3，该全长基因分离于湖北省的一例艾滋病患者，含有该全长基因的质粒(T0P0/05CNHB-hp3)保存于大肠杆菌ToplO中，该大肠杆菌命名为Topl0/05CNHB-hp3(EscherichiacoliTopl0/05CNHB-hp3)，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2006年6月20日，保藏号为=CCTCCNO:M206056oΑ、国内流行毒株全长序列的克隆本发明所获得的HIV-I国内流行株来自于湖北省的一例HIV感染者，将该患者的全血用淋巴细胞分离液分选其中的外周血淋巴细胞(PBMCs)，将该HIV阳性的PBMCs与健康人来源的PBMCs进行混合共培养，用QIAGEN公司的核酸纯化试剂盒提取共培养细胞的总DNA，分两段分别扩增该DNA中的9000bp和ISOObp的片段，使两个片段总长度可以覆盖全长的HIV基因，分别将扩增所得的PCR产物连接入Invitrogen公司的pCR-XL-T0P0载体，分别获得连接有ISOObp和9000bp的载体质粒，将所获得的两个质粒T0P0-HIV9K和T0P0-HIV1.8K均用PvuI和BspT104I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收TOPO-HIV9K质粒中酶切下来的11.2kb片段和T0P0-HIV1.8K质粒中酶切下来的2kb片段，将回收的两个片段连接后转化大肠杆菌ToplO(来源写明)，获得了具有HIV-I全长基因的质粒T0P0/05CNHB-hp3克隆Topl0/05CNHB-hp3，经测序显示所克隆的一种HIV全长基因，一种分离的艾滋病毒株的全长基因，其序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。SEQIDNO.1是本发明提供的一种HIV病毒全长基因的核苷酸全序列，其编码区全长9642个核苷酸，此全长基因编码多个蛋白以及非蛋白的病毒特征序列。该基因的功能鉴定数据或该基因编码的蛋白质的活性功能如下HIV基因组长约9.29.7kb，含gag、Pol、enV、3个结构基因，及至少6个调控基因(TatRev、Nef、Vif、VPU、Vpr)并在基因组的5'端和3'端各含长末端序列。HIVLTR含顺式调控序列，它们控制前病毒基因的表达。已证明在LTR有启动子和增强子并含负调控区。1.gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。2.Pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。3.env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gpl60，gpl20和gp41。gpl20含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gpl20V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gpl20与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。4.TaT基因编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。5.Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序(Cis-Actingrepressionsequance,Crs)去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。6.Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIvcDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必箭ο7.Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。8.VPU基因为HIV-I所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。9.Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。B、基于gag基因的DNA疫苗ρ⑶NA-gag在诱导动物产生特异性抗体中的应用通过引物设计在上下游引物上分别加入有EcoRI和BamHI酶切位点，用该引物对gag-F5‘-GAAGAATTCATGGGTGCGAGAGCGTCAG-3‘和gag-R5‘-GAAGGATCCTTATTGGGACGAGGGGTCG-3‘扩增全长基因质粒T0P0/05CNHB-hp3中的gag基因，并利用弓丨入的酶切位点将扩增产物克隆到表达载体P⑶NA3.1(购自Invitrogen公司，下同)中获得真核表达质粒pCDNA-gag，载有全长基因中786-2292bp区间的完整的gag基因；通过转染293T细胞证实gag蛋白可正常表达；将该真核表达载体通过肌肉注射方式免疫小鼠，可在小鼠血清中检测到gag蛋白的特异性抗体，证实该基因作为疫苗应用可诱导免疫动物产生特异性免疫反应。C、基于gpl20基因的DNA疫苗ρ⑶NA_gpl20在诱导动物产生特异性抗体中的应用·通过引物设计在上游引物gpl20-F:5，-GGATCCGCCATGGAAAAATTGTGGGTCACAGT-3，中引入BamHI酶切位点和起始密码ATG，在下游引物gpl20-R5’-CTCGAGTTATCTTTTTTCTCTTTGCACCACACT-3’中引入XhoI酶切位点和终止密码，用该对弓丨物扩增全长基因质粒T0P0/05CNHB-hp3中的gp120基因，并利用引入的酶切位点将扩增产物克隆到表达载体P⑶NA3.1中获得真核表达质粒ρ⑶NA-gpl20，载有全长基因中6319-7772bp区间的完整的gpl20基因；通过转染293T细胞(购自北京北方伟业有限公司)证实gpl20蛋白可正常表达；将该真核表达载体通过肌肉注射方式免疫小鼠，可在小鼠血清中检测到gpl20蛋白的特异性抗体，证实该基因作为疫苗应用可诱导免疫动物产生特异性免疫反应。D、基于逆转录酶基因的药物敏感性检测中的应用用上游弓丨物RT-L:CGGCATATGCCCATTAGTCCTATTGAGA和下游弓丨物RT-RTTATAGTACTTTCCTGATTCCAGCA扩增全长基因质粒T0P0/05CNHB_hp3的逆转录酶基因，并将该扩增产物连接到PMD18-T(购自宝生物公司)载体中得到克隆有RT基因的载体克隆PMD-RT(来源写明)，其中载有对应于全长基因2549bp至4228bp区间的逆转录酶基因；用引物对M41L-F:AAATTTGTACAGAACTGAAAAAGAAGGGA和M41L-RCCCTTCTTTTTCCAGTTCTGTACAAATTTC对pMD-RT质粒引入突变M41L，获得引入突变的质粒PMD-RT/41L；将原有的RT基因和M41L突变型的RT基因分别克隆到表达载体pET32a(购自北京捷瑞生物)中，获得表达质粒ρΕΤ-ρ66、ρΕΤ-ρ66ΤΜ41、ρΕΤ-ρ51、ρΕΤ-ρ51ΤΑΜ41，在体外原核表达和纯化RT蛋白，并检测原RT蛋白和M41L突变型RT蛋白对于抗逆转录药物的抗性；结果证实了M41L突变可提高RT蛋白对于逆转录酶抑制剂药物的抗性。证实该基因在应用于抗逆转录药物的检测时具有实际应用价值。本发明提供了一株HIV病毒(艾滋病毒)的全长基因，该全长基因命名为05CNHB-hp3,含有该全长基因的质粒T0P0/05CNHB-hp保存于大肠杆菌ToplO中，该大肠杆菌命名为Topl0/05CNHB-bp3(EscherichiacoliTopl0/05CNHB_hp3)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2006年6月20日，保藏号为CCTCCN0:M206056。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果本发明所获得的HIV病毒株序列来自于我国现流行毒株，该毒株的全长序列并不等同于以往毒株，具有中国流行株的自有特征。基于该序列编码的gag、gpl20基因通过克隆到表达载体中，该载体DNA肌肉注射小鼠后可在小鼠血清中检测到相应抗体，证实该载体DNA可作为DNA疫苗的应用。基于该序列编码的逆转录酶(RT)基因，在体外原核表达后可检测出表达蛋白具有逆转录功能，对于该基因引入相应氨基酸突变可导致表达的蛋白对于抗逆转录病毒药物的敏感性改变，证实该基因具有检测RT酶对药物敏感度的应用。(请补充实验数据)图1为一种HIV病毒的全长基因(05CNHB_hp3)的扩增和克隆流程图。图2为质粒05CNHB_hp3被MluI和NotI内切酶酶切片段琼脂糖凝胶电泳照片。用限制性内切酶MluI和NotI酶切质粒p05CNHB_hp3。泳道1酶切质粒p05CNHB_hp3后有9.8kb片段切出；泳道2=DNA分子量标记。图3为9kb长度的PCR产物照片。以Primer-IF和Primer-IR扩增经分离的病毒株05CNHBhp感染健康人外周血单核淋巴细胞(PBMCs)提取的细胞DNA产生的片段。泳道1=PCR扩增产生的目的片段9040bp；泳道2=DNA分子量标记。图4为1.8kb长度的PCR产物照片。以Primer_2F和Primer_2R扩增经分离的病毒株05CNHBhp感染健康人外周血单核淋巴细胞(PBMCs)提取的细胞DNA产生的片段。泳道1:PCR扩增产生的目的片段1831bp；泳道2=DNA分子量标记。图5为表达载体pCDNA-gag诱导表达gag蛋白的westernblot结果照片。泳道1是蛋白marker，泳道2是空载体，泳道3是未诱导的细胞上清，泳道4是经诱导的ρ⑶NA-gag表达上清。图6为ELISA法测定不同稀释度的抗血清，可见在IO5稀释度下仍可检测出P24的抗体。图7为表达载体pCDNA_gpl20在细胞中表达上清的westernblot结果。显示gpl20蛋白得以正常表达。图8为ELISA法测定免疫小鼠不同浓度稀释抗血清中gpl20抗体。结果显示免疫小鼠血清稀释IO4倍仍能检测出gpl20的抗体。图9为RT解除末端类核苷封闭延伸底物长度结果。与野生型RT比较，RTTam41能够更有效地将封闭的模板_引物末端AZTMP删除并延伸获得38bp的终产物。具体实施例方式实施例1一株HIV病毒的全长基因克隆一、HIV阳性材料获取和细胞分离HIV1型病毒感染者血液通过湖北省武汉市疾病预防控制中心采集，健康人血液由湖北省武汉市中心血站提供。载体试剂盒T0P0XLPCRCloningKit购自美国Invitrogen公司。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程研究所。植物血球凝集素(PHA)、白细胞介素(IL-2)购自长春生物制品研究所。1.分离血液PBMCs1)抗凝全血倒入尖底离心管中，室温(20-25°C，以下相同)下2，OOOrpm/min离心30mino2)取中间白细胞富集层，置入离心管中，并加入其4倍体积含牛血清(体积比，下同)的PBS缓冲液。3)另取一尖底离心管，预先在其中加入淋巴细胞分离液，其上缓缓加入细胞-PBS混合液，室温下2，OOOrpm/min,离心30min。4)步骤三离心后液体分上下两层，取两层液体中间界面的淋巴细胞层转移至另一离心管中，加入含牛血清的PBS重悬，常温下(25°C-30°C)2，000转/分钟离心lOmin。5)弃上清，加入含牛血清的PBS重悬，2，OOOrpm/min离心lOmin。6)弃上清，用含有10%牛血清1640培养液重悬细胞，37°C5%CO2(质量比，下同)培养。2.共培养感染者PBMCs和健康人PBMCs，分离扩增HIV-I病毒。将感染者PBMCs与用PHA刺激生长3天的健康人PBMCs混合，用含有20U/ml的IL-2、10%胎牛血清的1640培养液，37°C5%CO2培养。二、HIV全长基因扩增和克隆1、用Qiagen公司生产的细胞基因组DNA提取试剂盒(QIAampDNAMiniKit)提取细胞基因组DNA。2、PCR扩增病毒全长基因用上游Primer-IF:aaatctctagcagtggcgcccgaacag禾口下游弓|物Primer-IRgcactcaaggcaagctttattgaggct做引物对扩增从HIV病毒全长基因5'端LTR末端与PBS位点连接区起始至3'端LTR近TO区的R区末端共计9kb片段(图3)。用上游引物Primer-2F:tggaagggctaatttac禾口下游弓丨物Primer-2R:tcatcatttcttctagtgtagc做弓丨物对扩增HIV病毒全长基因5'端1.Skb的片段(图4)。反应条件如下使用大连宝生物公司生产的LATaqDNA聚合酶，在无菌PCR管中加入4ullOXLATaqPCR缓冲液，2ulIOmM4dNTPs，20uM上游及下游引物各lul，模板DNA，2ULATaq聚合酶，加水至40ul总体积。扩增9kb的反应条件为94°C5min，94°C10s,62°C30s，68°ClOmin，10个循环；94°C10s，55°C30s,68°ClOmin，20个循环；72°CIOmin;4°C⑴；扩增1.8kb的PCR扩增条件为94°C5min,94°C30s,49°C30s,72°C2minl0s,35个循环；72°CIOmin；4°C⑴。3、TAE-琼脂糖凝胶电泳和回收PCR产物。分别用0.7%、1%(质量体积比，下同)琼脂糖凝胶(含lOng/mlEB)电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒回收，PCR产物最后溶于30ul的ElutionBuffer中。4、DNA连接、转化大肠杆菌在无菌Eppendorf管中加入4ulPCR产物，IulpCR_XL-TOPOvector，混勻，室温连接5min，加入Iul6XTOPOCloningStopsolution终止连接反应；将2ul连接产物加入到T0P0XLPCRCloningKit的TOPlO感受态细菌，混勻，2，500V电击转化，加入450ulSOC培养液，37°C剧烈振荡培养lh，将混合液涂布在硫酸卡那霉素抗性的LB培养基上，370C培养过夜。5、DNA序列测定将筛选出的阳性克隆菌送Irwitrogen上海英俊测序服务公司测序鉴定。6、质粒DNA制备通过菌落PCR鉴定，从上述步骤4中硫酸卡那霉素抗性的LB培养基平板上挑取含目的片段的单菌落，接种于5ml含硫酸卡那霉素抗性的LB液体培养基中，振荡培养过夜(37°C,200rpm/min)。在1.5ml无菌Eppendorf管中，倒入1.5ml菌液，提取质粒DNA，保存于-20°C备用。7、限制性内切酶酶切质粒DNA。将9KB和1.8KB片断克隆质粒用PvuI和BspT104I做双酶切，酶切反应参照限制性内切酶说明书操作，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收操作与PCR产物回收相同。8、两质粒酶切片段重组连接3'端9KB片段克隆质粒中酶切下来的11.2kb片段和5'端1.8KB短片段克隆质粒中酶切下来的2kb片段按照摩尔比110比例，用T4DNA连接酶于16°C连接过夜。9、酶切片段重组连接产物转化大肠杆菌将步骤8中连接产物20ul加入到IOOul的T0P10大肠杆菌感受态细胞中，混勻，置冰浴30min；42°C水浴热休克90s，并迅速放回冰上冰浴2min；加入880ulLB培养基，37°C剧烈振荡培养Ih；将培养液低速离心，去除上清900ul，重悬沉淀，涂布于硫酸卡那霉素抗性培养基，37°C培养过夜。10、从平板中挑取单菌落，提取质粒，进行酶切鉴定获得HIV-I全长基因克隆质粒Topl0/05CNHB-hp3，见图2。一种分离艾滋病毒株的全长基因，其序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。实施例2基于HIV-Igag基因的DNA疫苗构建和应用一、HIV衣壳蛋白gag基因DNA疫苗真核表达载体的构建及鉴定1、设计一对分别含有EcoRI和BamHI酶切位点的引物用于扩增gag基因，正向引物为gag-F5‘-GMGMTTCATGGGTGCGAGAGCGTCAG-3‘以及反向引物gag-R5‘-GMGGATCCTTATTGGGACGAGGGGTCG-3‘，用该对引物扩增质粒Topl0/05CNHB_hp3中相应的DNA片段；2、将上述扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳回收后用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，通过琼脂糖电泳胶回收1.5K的酶切片段，获得对应于全长基因中786-2292bp区间的片段，该DNA片段为完整的gag基因；3、用上述同样的内切酶处理真核表达载体ρ⑶NA3.1(购自Invitrogene公司)，琼脂糖电泳胶回收该双酶切后的载体；4、用T4DNA连接酶将上述gag基因片段连接入表达载体，并通过转化感受态大肠杆菌DH5a(购自大连宝生物公司)，获得表达gag基因的真核表达载体ρ⑶NA-gag。5、用EcoRI和BamHI双酶切鉴定所获得的ρ⑶NA_gag表达载体，并同时将所得载体质粒送至上海英骏公司进行测序鉴定。以上步骤具体操作按《分子克隆实验指南》进行。二、质粒真核表达和产物鉴定所获得的真核表达载体pCDNA-gag通过脂质体转染技术转染到真核细胞中进行蛋白表达鉴定，其操作步骤是1、转染前一天，在6孔培养板中接种293T细胞；2、当细胞生长至90%孔面积时，用Lipofectamine2000试剂将pCDNA-gag质粒导入293T细胞，具体步骤参阅Lipofectamine2000产品说明书。3、转染6h后，吸弃转染液，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640液2ml，继续孵育48h，后收集细胞，用Trizol试剂裂解细胞并提取总蛋白。4、将上述从细胞培养物中提取的的蛋白做SDS-PAGE胶电泳，并用HIVP24单抗做Westernblot鉴定表达的GAG蛋白。三、质粒DNA制备和小鼠免疫操作按质粒提取试剂盒说明书进行，DNA用生理盐水调整浓度至lyg/μ1，20°C保存待用。6周龄的BALB/C小鼠，随机分成2组，每组5只。实验组肌肉注射质粒ρ⑶NA-gag100μ1/只；对照组肌肉注射空质粒P⑶ΝΑ3.1100μ1/只。每只小鼠在每次接种前24h均需用0.25%(质量体积比)的布比卡因ΙΟΟμΙ预处理，分别在2、4周后同样剂量加强免疫，2组均在各次免疫前剪尾取血，6周时眼球取血进行免疫反应检测。四、免疫小鼠的免疫反应检测用ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗HIV_p24抗体，具体操作如下1、用重组表达的HIV_lp24蛋白作为包被抗原包被酶标板，3%(质量体积比)BSA封闭；2、加入不同稀释度的待测小鼠血清，37°C孵育30分钟；3、PBST缓冲液洗板五次，加入辣根过氧化物标记的羊抗鼠抗体，37°C孵育30分钟；4、PBST缓冲液洗板五次，加底物显色，37°C反应10分钟，在酶标仪450nm测量各孔OD值。结果显示经免疫小鼠的血清稀释IO5仍能检测到P24的抗体(见图6)，说明该疫苗应用取得了有效的免疫反应。实施例3HIV-Igpl20基因的DNA真核表达载体构建和疫苗应用一、HIV-I膜蛋白gpl20基因真核表达载体的构建及鉴定1、设计一对引物用于扩增HIV-I的gpl20基因并引入相应的酶切位点和起始密码，上游引物5，-GGATCCGCCATGGAAAAATTGTGGGTCACAGT-3，中引入了BamHI酶切位点和起始密码ATG；下游引物5，CTCGAGTTATCTTTTTTCTCTTTGCACCACACT-3’中引入了XhoI酶切位点和终止密码。用该对引物扩增质粒Topl0/05CNHB-hp3中相应的DNA片段；2、将上述扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳回收后用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，通过琼脂糖电泳胶回收1.4K的酶切片段，获得对应于全长基因中6319-7772bp区间的片段，该DNA片段为完整的gpl20基因；3、用上述同样的内切酶BamHI和XhoI处理真核表达载体ρ⑶NA3.1，琼脂糖电泳胶回收该双酶切后的载体；4、用T4DNA连接酶将上述gpl20基因片段连接入表达载体，并通过转化感受态大肠杆菌，获得表达gpl20基因的真核表达载体ρ⑶NA-gpl20g。5、用BamHI和XhoI双酶切鉴定所获得的表达载体ρ⑶NA_gpl20g，并同时将该载体质粒送至上海英骏公司进行测序鉴定。以上操作具体步骤按《分子克隆实验指南》进行。二、质粒真核表达和产物鉴定所获得的真核表达载体通过脂质体转染技术转染到真核细胞中进行蛋白表达鉴定，其操作步骤是1、转染前一天，在6孔培养板中接种293T细胞；2、当细胞生长至90%时，用Lipofectamine2000试剂将pCDNA_gpl20质粒导入293T细胞，具体步骤参阅Lipofectamine2000产品说明书，。3、转染6h后，吸弃转染液，加入含有10%FCS的RPMI1640液2ml，继续孵育48h，后收集细胞，用TrizolLS试剂裂解细胞并提取总蛋白(购自irwitrogene公司)，具体操作参见TrizolLS试剂盒说明书。4、将上述从细胞培养物中提取的的蛋白做SDS-PAGE胶电泳，转膜后一抗为13000兔抗HIV-lgpl20多克隆抗体，二抗为1200的HRP标记的羊抗兔IgG，DAB显色进行Westernblot分析以鉴定表达的gpl20蛋白。Westernblot分析显示gpl20蛋白得以正常表达(见图7)。三、质粒DNA制备和小鼠免疫操作按质粒提取试剂盒说明书进行，DNA用生理盐水调整浓度至1μg/μ1，"20°C保存待用。6周龄的BALB/C小鼠，随机分成2组，每组5只。实验组肌肉注射ρ⑶NA_gp120质粒100μ1/只；对照组肌肉注射P⑶ΝΑ3.1空质粒100μ1/只。每只小鼠在每次接种前24h均需用0.25%的布比卡因100μ1预处理，分别在2、4周后同样剂量加强免疫，2组均在各次免疫前剪尾取血，6周时眼球取血进行免疫反应检测。四、免疫小鼠的免疫反应检测用ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗HIVgpl20抗体，具体操作如下1、用重组表达的HIV_lgpl20蛋白作为包被抗原包被酶标板，3%(什么比？)BSA封闭；2、加入不同稀释度稀释的待测小鼠血清，37°C孵育30分钟；3、PBST缓冲液洗板五次，加入辣根过氧化物标记的羊抗鼠抗体，37°C孵育30分钟；4、PBST缓冲液洗板五次，加底物显色，37°C反应10分钟，在酶标仪450nm测量各孔OD值。结果显示免疫小鼠血清稀释IO4倍仍能检测出gpl20的抗体，说明该疫苗的应用取得了有效的免疫反应(见图8)。实施例4:HIV-I逆转录酶(reversetranscriptase,RT)基因的耐药性检测中的应用一、HIV-IRT基因克隆和突变导入用上游弓丨物RT-L:CGGCATATGCCCATTAGTCCTATTGAGA和下游弓丨物RT-RTTATAGTACTTTCCTGATTCCAGCA扩增质粒p05CNHB_hp3的逆转录酶基因并相应引入起始密码和终止密码，用琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物连接pMDIS-T载体(购自宝生物公司)，转化大肠杆菌后获得克隆有p05CNHB_hp的逆转录酶基因的质粒pMD-RT。具体操作《分子克隆》中有详细说明。用弓I物对M41L-F:AAATTTGTACAGAACTGAAAAAGAAGGGA禾口M41L-RCCCTTCTTTTTCCAGTTCTGTACAAATTTC对pMD-RT质粒进行突变引入1、以pMD-RT质粒为模板，用引物M41L-F和M41L-R进行PCR扩增，共20个循环。2、在扩增产物20μ1中加入DPNI内切酶1μ1，以消化原质粒；转化大肠杆菌，在氨苄青霉素LB平板上挑取克隆，获得引入M41L突变的质粒pMD-RT/41L。二、HIV-IRT原核表达载体的构建以pMD-RT和pMD_RT/41L的克隆为模板扩增分别扩增RTp66和p51，用于扩增p66和p51基因的引物对(p66L/p66R，p66L/p51R)在引物的两端分别加入了酶切位点NdeI和Xhol。RTp66和p51的PCR产物用QIAquickGelExtractionkit进行胶回收纯化。PCR产物回收后直接用NdeI和XhoI进行双酶切，再与同样双酶切的原核表达载体pET32a(购自北京捷瑞生物)连接，连接产物转化大肠杆菌e.coli.DH5α(购自大连宝生物公司)，挑选阳性克隆，提取质粒送公司进行测序，确定Ρ66和ρ55的阅读框是否正确。pET-p66WT、pET-p66TAM41、pET-p51WT、pET-p51M41。三、HIV-IRTp66和p51蛋白的诱导表达将pET_p66和pET_p51重组质粒转化感受态e.coli.AD494，在含30μg/mlKan+的LB固体平皿上涂板。分别挑取转化菌落，接种于30μg/mlKan+的LB培养基，37°C200rpm/min摇至对数生长期(A_约0.6^0.8)。1、诱导表达加入0.ImMIPTG的培养物在30°C下分别诱导5h，然后取IOOml诱导培养物，4°C，12000rpm/min离心lOmin，收集诱导表达菌体，用5ml蛋白重悬液重悬菌体，经超声波破碎以后，取Iml破碎后产物，4°C，12000rpm/min离心lOmin，得到细菌裂解上清及沉淀，上清和沉淀分别加入适量的上样缓冲液。2、SDS-PAGE检测蛋白表达诱导表达与纯化后的蛋白均以SDS-PAGE进行检测。制备12%(质量体积比，下同)分离胶与4%积层胶，电泳系统为Amershammini-veticalgelelectrophoresis。在样品中加入等体积的2X上样缓冲液，沸水浴5min后立即冰浴，12000rpm/min，离心lmin。凝胶孔中加入10μ1的样品，先以90V电压下电泳，待溴酚兰指示剂进入分离胶后，调电压为150V至电泳结束。取下分离胶考马斯亮蓝R250染色液染色。弃去染色液，加入脱色液，室温脱色至背景透亮。3、HIV-IRTp66和p51蛋白的亲和纯化将培养至生长对数期的菌液按1100比例转接至400ml新鲜的LB培养基(含30μg/ml的Kan+)，37°C200rpm/min摇至对数生长期(OD600=0.60.8)，然后加入IPTG至终浓度0.ImM，在30°C下诱导表达5h。4°C8000rpm/min离心IOmin收集表达菌体，用预冷的PBS洗涤菌体一次，4°C，8000rpm/min离心lOmin，用15ml的蛋白重悬缓冲液重悬菌体。菌体充分重悬后，加入溶菌酶至终浓度lmg/ml，用超声波裂解菌体(冰浴)，4°C，12000g离心20min去除不溶物，收集上清。上清用2ml镍螯合His-蛋白亲和层析树脂纯化。4、蛋白浓度测定参照Bradford方法测定蛋白浓度，用TIANGEN公司的Bradford蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。(1)将0μ1、2μ1、4μ1、6μ1、8μ1、10μ1、14μ1、18μ1BSA标准溶液(lmg/ml)分别加入到试管中，加入PBS补足到οομ1；(2)将适当体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到100μ1；(3)向各试管中加入500μ1考马斯亮蓝染液(G-250)，混勻，室温放置5-lOmin；(4)用印pendorf公司Biophotometer选中Bradford，测定BSA标准蛋白稀释品的595nm的吸光值(A595)，得到标准曲线，然后测定样品的A595，直接获得样品中蛋白浓度。5、HIV-IRT蛋白聚合酶活性检测利用Roche公司的ReversetranscriptaseAssay(colorimetric)kit检测含有F214L突变及其他突变的HIV-IRTp66和p51蛋白的聚合酶活性。(1)将野生型和M41L突变的HIV-IRTp66和p51蛋白分别按照摩尔比11进行混勻，将混勻后的蛋白分别命名为RTwt、RTtam41；(2)用lysisbuffer稀释100倍、1000倍，取40μ1力卩入Eppordorf管中，再力口入20μ1reactionmixture[含有template/primer:poly(A)Xoligo(dT)15)以及nucleotides(DIG-dUTP，biotin-dUTP和dTTP)]，37°C温育8h进行反应；(3)将上述60μ1反应液转移至Microplatemodules中，并用coverfoil覆盖，37°C温育Ih；(4)将Microplatemodules中的反应液移去，每个反应孑L用250μIwashingbuffer洗涤5次，每次30s；(5)每孔加入200μ1anti-DIG-POD，并用coverfoil覆盖，37°C温育Ih0(6)移去每孔中的溶液，用250μ1washingbuffer洗涤5次，每次30s；(7)每孔加入200μ1ABTs底物溶液，室温下放置显色，用酶标仪读板(吸收波长405nm)。四、HIV-IRT核苷酸删除实验(Excisionassays)1、模板引物退火<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2XNaCl+乙酸镁(300raM)5ddH202总体积10将上述反应体系加热至90°C，3min，缓慢降至室温。用IOXH印es稀释4倍，至终浓度0.75μMo2、配制如下反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>将上述反应体系在37°C温育lOmin。3、将AZT-TP(IOmM)或d4TTP(10mM)用IOXH印es，IOX乙酸钾，IOXDTT稀释至终浓度62.5μM04、取20μ1稀释后的AZTTP(62.5μΜ)或d4TTP(62.5μΜ)与20μ1反应体系(2)混合，37°C温育lh，加热至90°C，5min,终止反应并灭活RTWT。立即冰浴5min。5、配制如下反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在如上体系中分别加入10(T200nmol的RTWT、RTtam41,并用ddH20补足至10μ1。6、将10μ1反应体系(5)与40μ1反应体系(4)混合，37°C温育，在Omin，5min，IOmin,20min,30min,40min,60min,90min取5μ1，90°C加热5min终止反应，立即冰浴5min,加入5μ12Χ甲酰胺上样缓冲液，准备进行核酸变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。7、核酸变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(20%)按如下体系配制变性变性聚丙烯酰胺凝胶<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>混合上述试剂，在55°C水浴中加热3min，促进尿素溶解。从水浴中取出溶液，冷却至室温，不断搅拌混合物。加入330μ1新配制的1.6%的过硫酸铵，混勻。加入5μITEMED，混勻溶液，灌胶。凝胶孔中加入10μ1的样品，200V电压下电泳2.5h。核苷酸删除实验实验分为两步，首先，将HIV-IRTwt与模板-引物以及AZT三磷酸(AZTTP)或d4T三磷酸(d4TTP)共同孵育，引物末端掺入AZTTP或d4TTP而被封闭；然后，分别加入待检测的重组酶(RTWT、RTtam41)、dNTPs和3.2mM的ATP进行引物解封闭和延伸反应，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测38nt长度产物链的产生情况。与比野生型RT比较，RTtam41能够更有效地将封闭的模板_弓丨物末端AZT-MP和d4T-MP删除而产生38bp的最后产物，证实了该突变的耐药特性。(图5)所涉及的序列及记号1.SEQIDNO.1的信息SEQIDNO.1是本发明提供的一株HIV病毒全长基因的核苷酸全序列，其编码区全长9642个核苷酸，此全长基因编码多个蛋白以及非蛋白的病毒特征序列。(1)序列特征长度9642bp类型核苷酸链性单链拓扑结构线性(2)分子类型寡核苷酸。(3)序列描述:SEQIDNO.1(4)序列表见下述内容。SEQUENCELISTING<110>中国科学院武汉病毒研究所<120>—种艾滋病毒的全长基因及应用<130>—种艾滋病毒的全长基因及应用<160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>9641<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)<400>1tggaagggctaatttactcccaaaagagacaagagatccttgatctgtgggtctaccata60cacaaggcttcttccctgattgggacaactatacaccagggccaggaatcagataccctc120tgacctttggatggtgcttcaagctagtaccagttgatccagagcaggtagaagaagcca180acaaaggagagaacagctgcttgctacatcctataagccaacatggaacagatgacccag240agagagaagtgctgatgtggaagtttgacagccacctagccttccatcacatggcccgag300agaaacatcctgagttctacaaagactgctgacactgagctatctacaagggactttccg360ctggggactttccagggaggcgtggcatgggcgggaccggggagtggcgagccctcagat420gctgcatataagcagccgcttttgcctgtactgggtctctctagtcagaccagatccgag480cctgggagctctctggctgattagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgcctt540gagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctca600gaccctttagtttgtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacgcgaaagcg660aaagtgagaccagaggagatctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacagca720agaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccattttttgactagcggaggctagaagga780gagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagtggcggacaattggatagatgggaaagaa840ttcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagca900gggagctggaacgattcgcagttaatcctggcctcttagaaacagcagaaggttgtagac960aaatactgcaacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaattgaaatcattat1020tcaatgcagtagcagtcctcta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agccataataagaattctgcaacaactgct5760gtttactcatttcagaattggatgtcaacatagcagaataggcattactcgacagaggag5820agcaagaaatggagccagtagatcctagattagagccctggaagcatccaggaagtcagc5880ctaagactgcttgtaacaattgctattgtaaaaaatgcagctttcattgccaagtttgtt5940tcacaaaaaaaggcttaggcatctcctatggcaggaagaagagaagacaacgacgaagaa6000ctcctcaagacagtcaaactcatcaagtttctctaccaaagcagtaagtaatatatgtaa6060tgcaatctttgcaagctttaaccatttttgcaatagtagctttaatagtagtagcaataa6120tagcaatagttgtgtggaccatagtattactagaatataggaaaatattaagacagagaa6180aaatagataggttaattgatagaataagagaaagagcagaagacagtggcaatgagagcg6240acggggatcaggaagaattatcagcattggagatggggcaccttattcctcggaatgctg6300atgatctgtagtgctgcagaaaaattgtgggtcacagtctattatggggtacctgtatgg6360aaagaaacaactaccactctattttgtgcatcagaggctaaagcatatgctacagaggta6420cataatatttgggccacacatgcctgtgtacccacagaccccaacccacaagaagtagtc6480ttggaaaatgtgacagaaaattttaacatgtgggaaaataacatggtagaacagatgcat6540gaagatataatcagtttatgggatcaaggcctaaagccatgtgtaagattaaccccactc6600tgtgttactttaaattgcactgatttcaagagtaatagtaccagtagtaataacagtagt6660acaacagagaaaggagaaataaaaaactgctctttcaatatcaccacaagcacaggaact6720aaggtaagagactctgcactttttaataagcttgatgtattaccaatagataatagtagt6780accagctataatagtagtaccagcaataggtatcacagctataggttgatacattgtaac6840acctcaagaattacacaagcttgtccaaaggtatcctttgagccaattcccatacattat6900tgtaccccggctggttttgcgctcctaaagtgtaacaataaaacgttcaatggaatagga6960ccatgtacaaatgtcagtacagtacaatgtacacatggaattagaccagtagtaacaact7020caactgctgttgaatggtagtttagcagacgaagaggtagtaattagatctaaaaatttc7080acagacaatgctaaaatcataatagtacagctgaaacaatccgtagaaattaattgtaca7140agacccaacaacaatacaagaaaaaggataactatgggaccagggagagtattgtataca7200acaggacaaatagtaggagatataagaaaagcacattgtaaccttagtagaccacaatgg7260gatgacactctaagacaggtagttggaaaattaagagaacaatttgggaacaaaacaata7320atctttaatcaatctgcaggaggggatccagaggttgtaatgcacatttctaattgtgga7380ggggaatttttctactgtaatacctcacgactgtttaatagtacttggtataataatggt7440acttggaataatgctagtactgggaatgatagcactattatactcccttgcagaataaaa7500caaattgtaaacaggtggcaggaagtagggaaagcaatatatgcccctcccattgcagga7560ccaattaattgttcatcaaaaattacagggttactattaacaagagatggtgggattaat7620aagactgacaccgagaccttcagacctggaggaggagatatgagagacaattggagaagt7680gaattatataaatataaagtagtgaaaattgaaccattaggagtagcacccaccagggca7740aagagaagagtggtgcaaagagaaaaaagagcagtgggagcaataggagcgatgttcctt7800gggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaataacgctgacggtacag7860gccagacaattgttgactggtatagtgcaacagcaaagaaatttgctgagagctattgag7920gcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaaacagctccaggcaagagtc7980ttggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctagggatttggggttgctctgga8040aaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctcacgat8100gagatttggaataacatgacttggatggagtgggaaagacaaattgacaattatacagca8160gaaatatacaccttaattgaacaatcgcagaaccaacaagaaaagaatgagttagaacta8220ttggaattggataagtgggcaagcttgtggaattggtttaacatgacacaatggctgtgg8280tatattaaaatattcataatgatagtaggaggcttgataggtttaagaataatttttgct8340gtactttctatagtaaatagagttaggcagggatactcaccattgtcattgcagacccac8400ttcccaacccagaggggacccggaaggcccgaaggaatcgaagaagaaggtggagagcga8460gacagaggcagatccgagagattagtgaacggattcttgacacttatctgggaggatcta8520cggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgagagacttactcttgattgtagcgagg8580attgtggaacttctgggacgcagagggtgggaagccctcaaatattgggggaatctcctg8640cagtattggattcaggaactaaagaatagtgctattagcttgcttaacgccacagccata8700gcagtaggtgaagggacagataggattatagaagtagcacaaagagcttggagagctatt8760ctcaacatacctacaagaatcagacagggcctcgaaagagctttgctataagatgggagg8820caagtggtcaaaaggttgtatggctggatggcctagtgtgagggaaagaatggaacgagc8880tgagccagcagcagatggggtgggagcagtatctcgagacctgggaagacatggagcaat8940cacaagtagcaatacagcaaatgatgcctgtgtatggctagaagcacaagaggaggagga9000agtgggctttccagtcagacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaagggagcgtt9060agatctcagccactttttaagagaaaaggggggactggaagggctaatttactcccaaaa9120gagacaagagatccttgatctgtgggtctaccatacacaaggcttcttccctgattggca9180taactacacaccagggccagggatcagataccctctgacctttggatggtgcttcaagct9240agtaccagttgatccagagcaggtagaagaagccaacaaagaagagaacaactgcctgct9300acatcctatgagccaacatggaacagatgacccagagagagaagtgctgatgtggaagtt9360tgacagccgcctagccttccatcacatggcccgagagaaacatcctgagttctacaaaga9420ctgctgacaccgagctttctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtga9480catgggcgggaccggggagtggcgagccctcagatgctgcatataagcagccgcttttgc9540ctgtactgggtctctctagtcagaccagatccgagcctgggagctctctggctgattagg9600gaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgc964权利要求一种艾滋病毒株的全长基因，其序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的一种艾滋病毒株的全长基因在制备治疗或预防艾滋病病毒的药物检测中的应用。全文摘要本发明公开了一种艾滋病毒的全长基因及应用，将该HIV阳性的PBMCs与健康人来源的PBMCs进行混合共培养，提取共培养细胞的总DNA，分两段分别扩增，使两个片段总长度覆盖全长的HIV基因，将扩增所得9000bp和1800bp的片段连接入-XL-载体，获得两个质粒TOPO-HIV9K和TOPO-HIV1.8K，将所获得的质粒均用PvuI和BspT104I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收TOPO-HIV9K质粒中酶切下来的11.2kb片段和TOPO-HIV1.8K质粒中酶切下来的2kb片段，将回收的片段连接后转化大肠杆菌Top10，获得了HIV-1全长基因的质粒TOPO/05CNHB-hp3克隆Top10/05CNHB-hp3，经测序显示所克隆的一种HIV全长基因，序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。此hiv-1全长克隆有利于开发各种诊断试剂盒及相关药物。该基因在制备治疗或预防艾滋病毒的药物检验中的应用，对于中国的艾滋病的预防与控制具有更好的针对性。文档编号C12Q1/70GK101812469SQ20091027233公开日2010年8月25日申请日期2009年9月29日优先权日2009年9月29日发明者杨荣阁,童骁,谭建新申请人:中国科学院武汉病毒研究所