用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株 及其用途。
【背景技术】
[0002] 我国作为一个人口和粮食大国，近几十年来为了解决粮食问题，大量使用化学农 药来预防和控制病虫害，但也对环境造成了极大的污染，危害人类健康。据统计，我国农田 的平均农药使用量是世界平均水平的2~5倍（章建森.我国农药平均用量比世界高2. 5 至5倍.农药市场信息，2011 (7) :7)。化学农药的大量使用使许多病虫产生了严重的抗药 性，防治效果不断降低。与化学农药相比，生物农药具有一些明显的产业优势，主要表现为 以下几点：(a)可采用农副产品为生产原料，原料来源丰富且价格低廉；(b)生产设备通用 性较好，可生产多个品种；（c)产品具有较大的开发潜力，通过基因技术和生物工程技术实 现产品的再开发；（d)投资风险相对较小。因此，生物农药在农药市场的地位和作用愈来愈 重要，越来越受到世界各国政府的重视。
[0003] 天然吩嗪化合物是一类典型的微生物次级代谢产生的抗生素。由于吩嗪环的存 在，几乎所有的吩嗪类化合物都具有一定的氧化还原活性，能够与细胞内的活性成分发生 作用，进而积累多种超氧化物和过氧化物，因此具有广谱的抑制植物病原真菌的作用，且不 易产生耐药性。同时，吩嗪环上的不同取代基使得各种吩嗪类化合物呈现不同颜色，在稳定 性和抗菌谱上也存在一定的差异，可以作为不同的农业杀菌剂使用。天然的吩嗪类化合物 有包括吩嗪-1-甲酰胺、吩嗪-1-羧酸和2-羟基吩嗪等五十多种，在防治植物真菌性病害 方面起着重要的作用，具有广泛的应用价值。其中，吩嗪-1-羧酸的结构式如下：
[0004]
[0005] 假单胞菌，作为一类广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌，是最早发现产吩嗪化 合物的菌属。其中研究最多的是人类条件致病菌铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)，其他还包 括两个亚型的恶臭假单胞菌（P.putida)，四个亚型的焚光假单胞菌（P.fluorescens)，绿 针假单胞菌（P.chlororaphis)等。
[0006] 有研究人员率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能 有效控制真菌性根腐和莖腐的生物农药--吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA，CAS号为 2538-68-3)(专利号为CN1369566、CN200610023459. 9、CN200910198664. 2)，定名为"申嗪霉素"，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和 西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并获得了农业部颁发的新农药药证（农药登 记号TO20110314和TO20110315)。在许多地区进行的防治西瓜枯萎病的田间药效实验 结果表明，通过苗期的灌根和发病初期叶面的喷雾，申嗪霉素对西瓜枯萎病的防治达到 75%-80%。在大田推广是应用试验，申嗪霉素防治效果明显优于国内外同类产品，可有效 替代国外进口产品。目前在上海、江苏、江西和湖南等地推广应用达500万亩次以上，避免 经济损失5亿元。申嗪霉素因其具有广谱抑制各种农作物病院真菌，较其他药剂高效、促进 农作物高产、与环境相容性好等优点，已经成为一种广谱高效防止农作物病害的新型生物 农药，被农业部全国农业技术推广中心列为2011~2015年全国重点农药推广品种。2013 年，何亚文分离到一株铜绿假单胞菌PA120,可以同时合成两种吩嗪衍生物一一吩嗪-1-羧 酸和吩嘆-1-甲醜胺（phenazine-l-carboxamide,CAS号为 550-89-0,简称PCN)(专利号 CN201310511796. 2)〇
[0007] 此外，吩嗪-1-羧酸的合成还可以采用化学方法。2013年，李雨等报道了一种 如下所示的申嗪霉素合成方法，反应条件条件苛刻，原料价格价格相对昂贵，反应后处理 繁琐（专利号CN103373967)。2014年，朱红军等以1-甲基吩嗪为原料，通过三步合成 了吩嗪-1-羧酸，反应副产物多，原料转化率不高，分离纯化困难且存在环境污染的问题 (CN104045601A)。目前均未见到相关专利转化或者产业化的报道。
[0008] 因此，吩嗪-1-羧酸的工业化生产方法仍然是微生物合成，比如上海农乐公司的 申嗪霉素系列产品。但是，目前生物合成吩嗪-1-羧酸的专利菌株均为铜绿假单胞菌，该菌 属于人类的条件致病菌；此外，在这类细菌中，吩嗪-1-羧酸仅是一系列吩嗪衍生物的中间 产物，因此其代谢产物多，代谢调控复杂，阻碍了其菌种改造及吩嗪-1-羧酸产量的进一步 提升。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于克服上述技术中利用铜绿假单胞菌生产吩嗪-1-羧酸过程中 菌种致病性、代谢产物复杂、菌种改造困难等问题，提供一种利用绿针假单胞菌生产吩 嗪-1-羧酸的方法。
[0010] 本发明以绿针假单胞菌HT66为出发菌株，通过基因工程技术将HT66菌株中吩 嗪-1-羧酸的修饰基因PhzH敲除，构建HT66AphzH基因工程菌株，使得其次级代谢产物从 吩嗪-1-甲酰胺转变成吩嗪-1-羧酸，可以用于生产申嗪霉素。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0012] 第一方面，本发明提供一种用于生产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株，由敲除绿针 假单胞菌HT66(PseudomonaschlororaphisHT66)CCTCCN0:M2013467 基因组中的phzH基 因得到。
[0013] 作为优选方案，所述phzH基因的碱基序列如SEQIDNO. 1所示。
[0014] 作为优选方案，所述phzH基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0015] 作为优选方案，敲除所述phzH基因的方法包括插入突变法和无痕法。
[0016] 作为优选方案，所述插入突变法敲除phzH基因包括如下步骤：
[0017] A、扩增PhzH基因片段，并插入pE)Q8TC质粒中；
[0018] B、扩增卡那霉素或庆大霉素等抗性基因，插入phzH基因中间，使phzH基因发生插 入突变；
[0019] C、将突变后的phzH基因与HT66基因组中的phzH基因发生同源重组，根据抗性筛 选出阳性克隆，即可。
[0020] 作为优选方案，所述无痕法敲除phzH基因包括如下步骤：
[0021]i、扩增PhzH基因片段的上下游同源臂；
[0022] ii、融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中（该质粒为假单胞 菌和大肠杆菌的穿梭质粒）；
[0023] iii、使重组质粒上的phzH基因的上下游同源臂片段与HT66基因组中的phzH基 因发生同源重组，筛选阳性克隆，即可。
[0024] 第二方面，本发明提供一种用于制备上述的基因工程菌株的培养基，由按质量分 数计的如下原料组成：
[0025] 胰蛋白胨或大豆蛋白胨2. 0~4. 5 %、甘油1. 9~3. 8 %、硫酸镁.0. 02~0. 1 %、. 磷酸二氢钾〇. 01~〇. 1 %、余量为水，PH6. 8~7. 5
[0026] 该培养基还可以用于利用本发明的基因工程菌株发酵制备吩嗪-1-羧酸。
[0027] 第三方面，本发明提供了所述的基因工程菌株在防治真菌性病害的微生物农药中 的用途。
[0028] 作为有选方案，所述微生物农药以吩嗪-1-羧酸为活性成分。
[0029] 第四方面，本发明提供了 一种利用本发明所述的基因工程菌株发酵制备吩 嗪-1-羧酸的方法，包括如下步骤：
[0030] 将基因工程菌株在培养基中，于20~40 °C下发酵20~50h后，将培养基的pH调 节至4以下，用有机溶剂进行萃取，纯化，得到吩嗪-1-羧酸。
[0031] 本发明利用一株不同类型的绿针假单胞菌HT66(Pseudomonaschlororaphis HT66)CCTCCN0:M2013467出发，敲除其phzH基因后，该菌只能合成吩嗪-1-羧酸，而不能将 其进一步转化为吩嗪-1-甲酰胺。该菌属于植物根际促生细菌，无任何致病性报道；其发酵 水平高，野生株中吩嗪衍生物的量为420mg/L，大大高于其它的绿针假单胞菌或者铜绿假单 胞菌中的吩嗪合成水平；而且其原料简单易得，发酵周期短，24h就产生大量吩嗪-1-羧酸， 36h可达到最高吩嗪产量；副产物少，不仅易于进行代谢工程改造，而且经过有机溶剂抽提 后，产物纯度达到95%以上。因此它是吩嗪类化合物生产的理想菌种，适合大规模的开发和 应用。
[0032] 与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0033] 1、用于生产吩嗪-1-羧酸的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此 其环境友好，安全可靠；
[0034] 2、绿针假单胞菌的代谢产物种类少，代谢调控机制相对简单，易于进行代谢工程 改造；
[0035] 3、本方法生产成本低：本菌株营养要求简单，原料便宜易得，且发酵液中副产物 少，易于分离提取，生产工艺简单易行。
【附图说明】
[0036] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0037] 图1为绿针假单胞菌HT66和phzH敲除突变株中以PCR法分别扩增phzH基因及 其上下游片段的电泳图。其中，从左到右依次为marker，HT66,HT66AphzH;
[0038] 图2为绿针假单胞菌诱变高产P3株和phzH敲除突变株P3AphzH发酵液的对比。 其中，左边为P3AphzH株，右边为P3株；
[0039] 图3为诱变高产株P3发酵液抽提物的HPLC检测图；
[0040] 图4为基因工程菌株P3AphzH发酵液抽提物的HPLC检测图；
[0041] 图5为诱变高产株P3株的生长曲线及吩嗪产物曲线示意图；
[0042] 图6为基因工程菌株P3AphzH的生长曲线及吩嗪产物示意图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域 的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于 本发明的保护范围。
[0044]本发明的绿针假单胞菌HT66(PseudomonascholoraphisHT66)，该菌株已在中国 典型培养物保藏中心（简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编 为：430072,保藏日期为：2013年10月12日，保藏编号为：CCTCCNO:M2013467。
[0045] 实施盤IphzH基因体外突变体的构建-插入突变
[0046] 以pBS(kan)质粒为模板，PCR扩增得到卡那抗性基因kan。根据绿针假单胞菌HT66 基因组中的PhzH基因序列设计引物，
[0047]