高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高产2,3_ 丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。
【背景技术】
[0002] 产酸克雷伯氏菌(1(1613186113(?71:〇〇3)作为2,3-丁二醇的产生菌，具有适应环境 能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点被认为是工业 化生产的潜在菌株。但是，酸性副产物乳酸的积累仍是限制2,3_ 丁二醇产量提高的主要因 素，发酵过程中乳酸含量的增加，会抑制菌体的生长，不但降低了 2,3_ 丁二醇的产量，同时 增加了后续对2，3_ 丁二醇分离纯化的复杂性。
[0003] 另外，还存在2,3_ 丁二醇转化率低、生产强度低及纯度低的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3_丁二醇产量低、转化率低、生产强 度低及纯度低的问题，提供高产2，3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其 发酵方法。
[0005] 本发明高产2,3_ 丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进 行：
[0006] -、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建：
[0007] 二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建：
[0008] 以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别 用 ack-Li、ack_L2 和 ack-Ri、ack_R2 引物进行 PCR 反应；
[0009] 三、pack-L 和 pack-R 质粒构建：
[0010]向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25yL Taq(5UAx L)DNA聚合酶，72°C水浴中反应lOmin，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack-L和ack-R，将 片段ack-L和ack-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R;
[0011] 四、pack-LR质粒构建；
[0012]以pack-L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和Bgl II对质粒载体pldh-L进行双酶 切，选用限制性内切酶Xho I和BamH I对质粒载体pack-R进行双酶切，用T4DNA连接酶将 pack-R的酶切产物连接到pack-L质粒载体上，得到重组质粒pack-LR;
[0013] 五、pT_Kanr质粒构建：
[0014] 以pET-28a( + )为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物，对Kan"进行PCR扩增， 对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Karf质粒；
[0015] 六、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建：
[0016] 以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT-Kaf和pack-LR进行酶切，将获得的Karf片段插入质粒载体pack-LR中，构建质粒载体pT-LKR;
[0017] 选择限制性内切酶Bgl II和BamH I对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片 段ackL_Kanr-ackR;
[0018] 七、K.oxytoca HD79_01/pKD46菌株构建：
[0019] 将质粒pKD46电转化到K.oxytoca HD79-01 感受态细胞，得到K.oxytoca HD79-01/ pKD46菌株；
[0020] 八、同源重组片段ackL_Kanr-ackR转化K.oxytoca HD79_01/pKD46:
[0021] 将同源重组片段ackL-Karf-ackR电转化到K.oxytoca HD79-01/pKD46中，得到的 目的菌株为高产2,3_丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-02。
[0022] 步骤一所述产酸克雷伯氏菌（K.oxytoca)HD79已在文献《Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因（ack)的克隆与序列分析》（中国农学通报，2015。31(14):83-88)中 公开。
[0023] 上述方法构建的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：
[0024] 一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytoca HD79-02的单菌落接种到种子液培 养基中，30 °C，150r/min培养至对数生长期，得种子液；
[0025]二、然后将种子液以5%的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中， 于30°C，150r/min发酵156h后结束；
[0026]步骤一中所述种子液培养基配方：（NH4)2S〇4 lg/L、K2HP〇4 · 3H20 3.4g/L、 KH2P0U · 3g/L、MgS〇4 0 · 2g/L、酵母提取物lg/L、微量元素 2mlVL和铁溶液lmL/L，调pH值至 7.0,121°C高压灭菌15min，之后向每100mL种子培养基中加入经108°C高压灭菌20min的5g 葡萄糖粉末；
[0027]步骤二中所述发酵培养基配方：（NH4)2S〇4 6.6g/L、K2HP〇4 · 3H20 8.7g/L、 KH2P〇46.8g/L、MgS〇4 · 7H20 0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeS〇4 · 7H20 0.05g/L、ZnS〇4 · 7H20 0.001g/L、MnS〇4 · 7H20 0.001g/L和CaCl2 · 2H20 0.001g/L，调整溶液的pH值至7.0，121°C 高压灭菌15min，然后在其中加入经108°C高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。
[0028] 本发明的原理：
[0029] 本发明是针对已经敲除了乳酸脱氢酶基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株 1(1613丨86113(?71:〇〇3!1079-01，其酸性副产物乙酸的积累仍然限制2,3-丁二醇产量提高的 问题而设计的。ack基因编码的乙酸激酶是乙酸代谢途径的关键酶，本发明利用XRed同源重 组技术对K.oxytoca HD79-01中ack基因敲除，阻断乙酸的生成途径，促使碳流量更多流向 2，3-丁二醇，以期获得2，3-丁二醇高产菌株。
[0030] 首先，通过PCR技术扩增得到乙酸激酶基因的同源左右两臂片段，然后将该两臂片 段连接到卡那霉素抗性基因的左右两翼，形成一个表达盒ackL-Karf-ackR。将该表达盒转 入产酸克雷伯氏菌K.oxytoca HD79-01中，通过同源重组的方式，以卡那霉素抗性基因替代 乙酸激酶基因，从而完成对乙酸激酶基因的敲除。获得突变株由于不能有效的产生乙酸，使 菌株代谢通路发生改变，提高了 2，3-丁二醇的产量。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] 本发明成功敲除产酸克雷伯氏菌(Klebisella oxytoca)HD_79的ldh基因和ack基 因，构建Klebisella oxytocaHD-79-02菌株，减少乙酸和乳酸的产量，提高了2,3-丁二醇的 产量。
[0033] 其中2,3-丁二醇的产量由29.838/1提高到46.218/1，提高了54.9%。而乳酸则由 4 · 94g/L下降到2 · 45g/L，降低了 48 · 2 %。乙酸则由 4 · 28g/L下降到 1 · 59g/L，降低了 62 · 8 % · [0034] 2，3-丁二醇转化率提高了20 · 5% ; 2，3-丁二醇的生产强度提高了 106 · 5%。另外， 利用该菌株获得的2，3_丁二醇纯度由57.9%增加到71.2%。同时敲除ldh和ack会对菌体的 0D_ nm值降低，但是单一的凭借0D值并不能判断重组菌株的产2,3-BD的能力，本发明就是为 此提供了一个很好的证明。
[0035] 本发明关于基因敲除高效生产2,3_ 丁二醇的构建研究将为今后基因功能的研究 提供理论依据。
【附图说明】
[0036] 图1为ack-L基因和ack-R基因 PCR扩增产物电泳图；其中Μ为DNA Marker DL2000， 泳道1为ack-L基因 PCR产物，泳道2为ack-R基因 PCR产物；
[0037] 图2为ack-L基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
[0038] 图3为ack-R基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
[0039] 图4为Kan-up、Kan-down引物对的PCR扩增结果;其中Μ为DNA Marker DL2000;泳道 1-2为Karf基因的PCR产物；
[0040] 图5为Karf基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-5 为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
[0041 ]图6为ack-Li、ack-R2引物对PCR结果；其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道 1-2为PCR 产物
[0042]图7为出发菌株和重组菌株的pH值及0D值对比，其中?表示出发菌株K.oxytoca HD79的0D值，?表示重组菌K.oxytoca HD79-02的0D值，▲表示出发菌株K.oxytoca HD79的 pH值，Λ表示重组菌K · oxytoca HD79-02的pH值；
[0043] 图8为出发菌株和重组菌株的葡萄糖消耗及2,3_丁二醇产量对比，其中?表示出 发菌株K. oxytoca HD79的葡萄糖消耗，