片段ack-L和右臂片段ack-R的构建： W敲除了 Idh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株皿79-01基因组DNA为模板，分别用 ack-b、ack-L2 和 ack-化、ack-R2 引物进行 PCR 反应； S、pack-L和pack-R质粒构建： 向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25化化q SUAiL的 DNA聚合酶，72°C水浴中反应lOmin，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack-L和ack-R，将片 段ack-L和ack-R分别与PMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R; 四、 pack-LR质粒构建： Wpack-L为骨架，选用限制性内切酶化O巧邮gl II对质粒载体Pl化-L进行双酶切，选 用限制性内切酶化O I和BamH I对质粒载体pack-R进行双酶切，用T4 DNA连接酶将pack-R 的酶切产物连接到pack-L质粒载体上，得到重组质粒pack-LR; 五、 pT-KanT质粒构建： W祀T-28a ( + )为模板，利用Kan-UP和Kan-down为扩增引物，对Karf进行PCR扩增，对PCR 产物进行TA克隆，得到PT-KanT质粒； 六、 同源重组片段ac吐-KanT-ackR的构建： W重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶趾O I对重组质粒pT-KanT和pack-LR进 行酶切，将获得的KanT片段插入质粒载体pack-LR中，构建质粒载体pT-LKR; 选择限制性内切酶Bgl II和BamH I对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段 ackL-Kan^-ackR； 屯、K.0巧toca皿79-01/p邸46菌株构建： 将质粒9邮46电转化到1(.〇^;八〇。3皿79-01感受态细胞，得到1(.〇巧1:〇。3皿79-01/ pKD46菌株； 八、同源重组片段ackL-Kant-ackR转化K. oxytoca 皿79-〇 1/p邸46: 将同源重组片段ac化-KanT-ackR电转化到K.0巧toca皿79-01/p邸46中，得到的目的菌 株为高产2，3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.O巧toca皿79-02。2. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤一中敲除Idh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建方法具体 为： ① Idh基因同源左臂片段Idh-L和右臂片段Idh-R的构建： W产酸克雷伯氏菌皿79基因组DNA为模板，分别用1化-1^1、1化-L2和1化-Ri、1化-R2引物 进行PCR反应； ② pi化-L和pi化-R质粒构建： 向含有Idh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25化5U/化的 化qDNA聚合酶，72°C水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段1化-L和1化-R，将 片段1化-L和1化-R分别与pMD 18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为P1化-L和P1化-R; ③ pi化-LR质粒构建： Wpl化-L为骨架，选用限制性内切酶趾O I和EcoR I对质粒载体pi化-L与pi化-R分别 进行双酶切，用T4 DNA连接酶将Pl化-R的酶切产物连接到Pl化-L质粒载体上，得到重组质 粒P Wh-LR; ④ pT-Cnf质粒构建： WpGP704-Cm为模板，利用Cm-UP和Cm-down为扩增引物，对Cnf进行PCR扩增，对PCR产物 进行TA克隆，得到pT-Cnf质粒； ⑤ 同源重组片段W^-CmT-I化R的构建： W重组质粒Pl化-LR为骨架，选用限制性内切酶化O I对重组质粒pT-Cnf和Pl化-LR进行 酶切，将获得的Cnf片段插入质粒载体Pl化-LR中，构建质粒载体pT-LCR; 选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段 WhkCnf-WhR; ⑥ K.0巧toca皿79/p邸46菌株构建： 将质粒地D46电转化到K. O巧toca皿79感受态细胞，得到K. O巧toca皿79/p邸46菌株； ⑦ 同源重组片段1化kCmT-l化R转化K.O巧toca皿79/p邸46: 将同源重组片段1化心〇11^-1化R电转化到K.0巧toca皿79/p邸46中，得到的目的菌株为 高产2，3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.O巧toca皿79-01。3. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤二中ack-l^i 引物序列为5 '-GGAAGATCTTGAACTGCGGTAGCTCCTCTCTGAA-3 '， ack-L2引物序列为5 ' -CCGCTCGAGCTGAATTACGGACTCGTCGATCACC-3 '，ack-Ri引物序列为5 ' -CCGCTCGAGCAGACCATGCCGGAAGAATCCTATC-3'，ack-R2 引 物序列为5'-CGCGGATCCGGTGTCGTGCAGATGGAAGATGATG-3 '。4. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤二中PCR反应体系如下： PC民反应体系组分 脯入体积 终浓度 IOxPfU BuflTer with MgS〇4 5 叫一 Ix dNTPs 5 呼 戸r 0.2 mmol,'ViL 上游引物 2 0.4 Iimol,仙 下游引物 .2睐. 化4故ol/(iL 模板 DNA 10 - P扣 DNA F*olymerase IpL 0.05 U/p丄 加H20 25 IiL - PCR扩增的反应程序为： 步骤 温度 时飼 循环数 预变性 94 C 3min 1 变性 94r Imin 退火 5 8 TJ Imin 30 延伸 巧杞 Imk 幾延体 m 7妃in 15. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤五中 Kan-UP 引物序列为 5 ' -CCGCTCGAGTACATAAACAGTAATACAAGGGGTG-3 ' 和 Kan-down 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGA-3 '。6. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤五中PCR反应体系如下： PC民反应体系组々 加入体积 终浓度 10、Pfu BuiTer W 加 MgS〇4 ?山一 U dNTPs 5 |jL 各 0.2. ffim〇l/}xL 上游引物 2睐 0.4畔〇14山 下游引物 2 PL 0.4 ^molZpL 模板 DNA 10 _ PfU DNA 聚合酶 1 阵 0 05 UfuL ddHbO 25IJL - PCR反应程序如下： 步骤 温度 时简 循环数 预变性 Q4''C: Smin 1 变性 MC Imin 退火 淡巧 Imin 30 延伸 72'C 1.5min 终延伸 12T. Imm 1 b.7. 如权利要求1所述的方法构建得到的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按W 下步骤进行： 一、 将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytoca HD79-02的单菌落接种到种子液培养基 中，30°C，15化/min培养至对数生长期，得种子液； 二、 然后将种子液W5%的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中，于30 °C，150r/min发酵15化后结束； 步骤一中所述种子液培养基配方：（NH4)2S04 lg/L、K2HP〇4.3出0 3.4g/L、K出P〇4 1.3g/ L、MgS〇4 0.2g/L、酵母提取物Ig/L、微量元素 2mL/L和铁溶液ImL/L，调抑值至7.0，121°C高 压灭菌15min，之后向每IOOmL种子培养基中加入经108°C高压灭菌20min的5g葡萄糖粉末； 步骤二中所述发酵培养基配方：（畑4)25〇4 6.6邑/1、1(2册〇4.3出0 8.7邑/1、1(出?〇4 6.8邑/ L、MgS〇4 ? 7此0 0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeS〇4 ? 7此0 0.05g/L、ZnS〇4 ? 7出O O.OOlg/L、 MnS〇4 ? 7此0 O.OOlg/L和CaCl2 ? 2出0 O.OOlg/L，调整溶液的抑值至7.0，12rC高压灭菌 15min，然后在其中加入经108°C高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。
【专利摘要】高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法，涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题。构建方法：一、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建；二、pack-L和pack-R质粒构建；三、pack-LR质粒构建；四、pT-Kanr质粒构建；五、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建；六、K.oxytoca？HD79-01/pKD46菌株构建；七、ackL-Kanr-ackR转化K.oxytoca？HD79-01/pKD46。发酵方法：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株接种到种子培养基中，培养至对数生长期，得种子液；二、将种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，发酵，结束。本发明用于生产2,3-丁二醇。
【IPC分类】C12N15/74, C12N1/20, C12R1/22, C12P7/18
【公开号】CN105647953
【申请号】
【发明人】葛菁萍, 孙姗姗, 叶广斌, 凌宏志, 修宝林, 平文祥
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月18日