一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆 菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，可将大分子的蛋白质水解为氨基酸、小肽等产 物。中性蛋白酶是指最适作用PH为6. 0-7. 5的一类蛋白酶，作为一种生物催化剂，它具有 催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等的性质和优点。微生物由于具有生 长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点，因而备受人们的 青睐。据统计，微生物蛋白酶占据了世界整个酶销售市场约40%左右的份额，已成为市场上 蛋白酶生产的主要来源。大多数市售中性蛋白酶大都产自芽孢杆菌属。
[0003] 中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一。目前中 性蛋白酶已被广泛的应用于食品、皮革、毛皮、化妆品、医药等行业。其中，在畜禽饲料配方 中添加中性蛋白酶，可有效提高蛋白质的利用率和降低饲养成本；另外，中性蛋白酶具有较 强的脱毛能力，能够避免传统的皮革加工使用硫酸钠进行处理造成的环境污染；中性蛋白 酶应用于啤酒生产中，可排除蛋白质产生的"冷浑浊"现象；在洗涤剂用品中加入中性蛋白 酶可大大提高洗涤效果；在医药行业中，中性蛋白酶还可作为消化、消炎、化痰止咳等药物， 以及用于治疗跌打伤、水肿血肿，消除坏死组织等。
[0004] 中性蛋白酶的研究开发工作自上世纪七十年代就已开始，国内外都于上世纪八十 年代初实现产业化，但中性蛋白酶发酵单位一直很低，发酵不稳定，易受噬菌体和酵母的污 染。因此国内外科技工作者一直致力于加速开发新型中性蛋白酶高产菌株，提高生产菌株 的产酶能力，从而降低中性蛋白酶的生产成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌 awjioJi识/e/acieas)及其应用。本发明通过紫外诱变的方法筛选出一株中性蛋白酶高产菌 株，该菌株能高效分泌表达中性蛋白酶，为中性蛋白酶的广泛应用奠定了基础。
[0006] 本发明一方面涉及一种解淀粉芽孢杆菌突变株，为解淀粉芽孢杆菌FN61 a野ioJit/i/e/'acieas1FN61)，已于2015年9月14日保藏于中国武汉武汉大学 的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015527。
[0007] 本发明另一方面涉及一种中性蛋白酶，是由上述解淀粉芽孢杆菌突变株FN61发 酵得到的。
[0008] 所述中性蛋白酶在饲料和食品加工领域中的应用。
[0009] 本发明通过紫外诱变的方法获得的突变菌株解淀粉芽孢杆菌FN61能显著提高中 性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达14135U/ml，较出发菌提高了 42%。该突变菌所产中 性蛋白酶的最适作用pH为7. 5,与出发菌株一致，但突变菌产的蛋白酶在pH6. 5-8. 5范围内 的相对酶活普遍高于出发菌，从而说明突变菌产的蛋白酶比出发菌更适合在中性条件下发 挥作用；该突变菌产的蛋白酶最适作用温度为40°C，较出发菌没有发生改变，取得了意料 不到的技术效果。本发明所述突变菌株FN61产中性蛋白酶可广泛应用于饲料和食品加工 领域，前景广阔。
【附图说明】
[0010] 图1为突变菌FN61和出发菌FN产蛋白酶的作用pH-相对酶活曲线图； 图2为突变菌FN61和出发菌FN产蛋白酶的作用温度-相对酶活曲线图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方 法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解 和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
[0012] 对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下： 1、 蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法（GB/ T25327-2009). 2、 酶活单位的定义：Ig固体酶粉(或ImL液体酶)，在一定温度和pH条件下，Imin水 解酪蛋白产生Iyg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
[0013] 3、运用福林法进行蛋白酶活力测定，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售 福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液（42.4g/L)，三氯乙酸（65.4g/L)，梯度pH值缓 冲液，酪蛋白溶液（10. 0g/L)。反应过程如下：试管中加入ImL酶液，40°C温浴2min，加 入酪蛋白溶液ImL，摇匀后40°C温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对照先 加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢性定性滤纸过滤。取ImL滤液， 加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液ImL，40°C显色20min，于680nm波长，用10mm 比色皿测定吸光度。
[0014] 实施例1出发菌解淀粉芽孢杆菌FN的紫外诱变与筛选 出发菌：解淀粉芽孢杆菌FNa野ioJi识/efacieasFN)，该菌株由发明人付 娟于2014年5月分离自山东省青岛市崂山区林场土壤中，能发酵产中性蛋白酶。
[0015] 菌悬液制备 将出发菌解淀粉芽孢杆菌FN在LB斜面(酵母粉0. 5%，蛋白胨1%，NaCl1%，琼脂2%)上 划线接种，37°C培养24h;加入5mL0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下 来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋震荡10min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全 部转入15mL离心管，6000rpm离心3min收集菌体，取上清，用10mL生理盐水悬浮菌体； 洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至IO8个/mL. 1. 2紫外诱变处理及诱变剂量确定 打开9W紫外灯开关，预热约30min;取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为IO8 个/mL的菌悬液10mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距 离为15cm处，分别搅拌照射Imin，2min，3min，4min，5min;盖上平皿盖，关闭紫外灯， 黑暗中孵育30min。
[0016] 将照射后的菌悬液用0. 85%生理盐水梯度稀释至10^lO6;取10 4、10 5、10 6三个 稀释度的菌悬液各100yL，涂布LB平板，每个稀