一株3-羟基丙醛高产菌株及其在防治哺乳动物阴道感染中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物及其组合物，特别是涉及一种用于防治哺乳动物阴道感染 的微生物及其组合物。
【背景技术】
[0002] 益生菌素3-羟基丙醛（3-HPA)，CAS:2134-29-4,分子式C3H6O2，可溶于乙醇、乙 醚、丙酮，极易溶于水，易聚合，属于羟醛类化合物，性质比较活泼，无异味。益生菌素3-羟 基丙醛在水溶液中主要呈现3-羟基丙醛单体、水合物和环化二聚体三种状态。3-羟基丙醛 具有醛基和羟基，易发生羟基和醛基相关的反应，容易缩合。
[0003] 益生菌素3-羟基丙醛可由定殖于人及动物肠道内的细菌代谢甘油产生，其在生 物灭菌剂、抗感染治疗剂、生物交联剂、新型生物材料的前体等方面有着广泛的潜在用途。
[0004] 罗伊氏素的主要成分是3-羟基丙醛的单体、水合物和环化二聚体。研究表明， 15-30yg/ml的罗伊氏素就能抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的 生长。由于罗伊氏素既具广谱抗菌特性，又对人和动物无害，其用途正逐步被广泛开发，如 作为生物防腐剂，用于延长香肠、冷冻食品等的货价期；作为生物灭菌剂，用于不能高温灭 菌的食品牛奶、生物材料的灭菌；作为口香糖添加剂，用于杀死口腔病原菌预防龋齿；作为 抗感染治疗剂，替代抗生素用于动物病原虫引发疾病的治疗。
[0005] 益生菌素3-羟基丙醛单体是一个三碳的醇醛类化合物，可以和蛋白质中的胺基 反应形成交联。在酸性条件下，三个益生菌素3-羟基丙醛单体形成乙缩醛，可与自由胺基 进行双醛基交联反应；而在碱性条件下，可能发生类似于甲醛的单醛基交联反应。因此可以 作为新型交联剂，交联后生物组织的变性温度、交联指数、抗酶解能力和机械性能等与戊二 醛（glutaraldehyde)交联的生物组织相当，但其细胞毒性更低。因此可以取代化学合成的 戊二醛和环氧化合物作为新型的生物交联剂，从而克服化学交联剂处理生物组织所遇到的 组织硬化、钙化、细胞毒性过高及免疫反应过强等问题。
[0006] 此外，益生菌素3-羟基丙醛还可作为多种新兴化学品如丙烯醛、丙烯酸、1，3-丙 二醇等的前体，用于制备新型聚合物材料。
[0007] 妇科外阴和阴道感染疾病是女性的常见病和多发病，其发病率逐年上升，醋酸氯 己定和甲硝唑复方制剂是治疗这类疾病的常用药物。这些制剂有复方洗必泰、双唑泰栓剂 等，其中醋酸氯己定含量为Smg/粒，甲硝唑的含量为200mg/粒，用于治疗各种细菌、厌氧 菌、霉菌、滴虫等病原体引起的各种阴道炎。但醋酸氯己定/甲硝唑复方制剂只是在治疗早 期的感染疾病时效果明显，而在治疗较重的感染疾病效果不是很理想，且醋酸氯己定/甲 硝唑复方制剂在治疗阴道炎的同时，显示出较大的不良反应，表现为对阴道的局部刺激较 大，产生局部红肿现象；并且这些药物的使用还会抑制阴道内正常菌群活性，从而破坏阴道 内正常的生态平衡。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种生长周期短、益生菌素产量高的罗伊氏乳杆 菌，及其在防治哺乳动物阴道感染中的应用。
[0009] 本发明一株3-羟基丙醛（益生菌素）高产菌株，其特征在于：其为罗伊氏乳杆 菌（Lactobacillusreuteri)RS01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 9971，保藏日期为2014年11月14日。
[0010] 进一步，本发明的3-羟基丙醛高产菌株，所述罗伊氏乳杆菌RSOl的细胞壁染色呈 革兰氏阳性，无芽孢，菌体呈现短棒状，分布为单个或呈连接状。
[0011] 进一步，本发明的3-羟基丙醛高产菌株，所述罗伊氏乳杆菌RSOl菌体长I. 5-3um、 宽 0. 6-0. 9um。
[0012] 进一步，本发明的3-羟基丙醛高产菌株，所述罗伊氏乳杆菌RSOl的菌落光滑细 腻，边缘整齐，菌落大小均匀一致，乳白色、湿润、不透明。
[0013] 本发明一种利用罗伊氏乳杆菌RSOl生产3-羟基丙醛的方法，包括以下步骤：
[0014] -、制备培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷 酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0. 5g、硫酸锰0. 2g、L-半胱氨酸0. 5g、硫乙 醇酸钠〇? 05g、VB120. 005g、甘油3. 68g加水定容至1L，调节pH值为6. 8 ;
[0015] 二、将上述罗伊氏乳杆菌RSOl接入步骤一中制备的培养基中，37°C、溶氧量为0的 条件下，厌氧发酵5h;
[0016] 三、分离：第一次分离采用板框分离，收集菌体快速而且不易造成菌体死亡；然后 将分离的菌体接入新的培养基中，在37°C、溶氧量为0的条件下，培养4h;第二次分离采用 高速管式离心机，可以使目的产物与菌体有效分离；
[0017] 四、合并两次分离得到的发酵液。
[0018] 本发明中对上述菌种采用了同一菌种两次发酵的方法，得到高浓度的3-HPA。
[0019] 本发明一种3-羟基丙醛高产菌株在防治哺乳动物阴道感染中的应用，其特征在 于：用于制备各种治疗阴道炎或者预防泌尿生殖道感染的药物。
[0020] 本发明一株益生菌素高产菌株及其在防治哺乳动物阴道感染中的应用与现有技 术不同之处在于：
[0021] 1、易于培养：本发明采用了厌氧发酵，控制发酵过程中的氧气浓度；即可通过两 次发酵转化3-HPA，到高浓度的3-HPA。
[0022] 2、产量高：本发明中的罗伊氏乳杆菌RSOl经过诱变筛选后，菌种生长周期缩短一 半，目标产物（3-HPA)产量由原本几乎为0提升至2. 5-2. 8g/L。
[0023] 3、节能：本发明中的罗伊氏乳杆菌RSOl经过诱变筛选后，由于生长周期的缩短一 半以上，从而大大降低了生产成本，节约了水、电、汽等能源。
[0024] 4、安全、无毒副作用：采用本发明的罗伊氏乳杆菌RSOl的发酵液对SD系大鼠进行 灌胃和阴道注射，均验证无毒副作用。
[0025] 5、抗菌谱广：本发明的益生菌素高产菌株代谢产物对细菌、真菌、原虫引起的阴道 炎均有很好的治疗效果，证明其具有广谱的抗菌作用，可用于预防或治疗哺乳动物的阴道 感染。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的镜检图；
[0027] 图2为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的菌落图；
[0028] 图3为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的抑白色念珠菌图；
[0029] 图4为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的抑金黄色葡萄球菌图；
[0030] 图5为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的抑大肠杆菌图。
【具体实施方式】
[0031] 结合以下实施例与验证试验对本发明的一株益生菌素高产菌株及其在防治哺乳 动物阴道感染中的应用作进一步的说明。
[0032] 本发明的罗伊氏乳杆菌RSOl为太空诱变筛选出的正向突变菌株。在高能粒子 辐射、微重力、交变磁场的条件下，罗伊氏乳杆菌发生多种具有不同程度代谢产生3-羟基 丙醛能力的菌株，通过对致病菌群进行不同梯度的杀菌试验，筛选获得60min内杀菌率在 90%以上的菌株，即本发明中的益生菌素（3-羟基丙醛）高产菌株。
[0033] 图1为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的镜检图；图2为本发明罗伊氏乳杆菌RSOl的 菌落图。
[0034] 实施例1
[0035] 本发明中益生菌素高产菌株的生产3-羟基丙醛的方法，按以下步骤进行：
[0036] -、制备培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷 酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0. 5g、硫酸锰0. 2g、L-半胱氨酸0. 5g、硫乙 醇酸钠〇? 05g、VB120. 005g、甘油3. 68g加水定容至1L，调节pH值为6. 8 ;
[0037] 二、将本发明的罗伊氏乳杆菌RSOl接入步骤一中制备的培养基中，37°C厌氧发酵 5h；
[0038] 三、分离：第一次分离采用板框分离，收集菌体快速而且不易造成菌体死亡；然后 将分离的菌体接入新的培养基中，在37°C、溶氧量为0的条件下，培养4h;第二次分离采用 高速管式离心机，可以使目的产物与菌体有效分离；
[0039] 四、合并两次分离得到的发酵液。
[0040] 根据3-羟基丙醛在强酸条件下加热脱水形成丙烯醛，而色氨酸在浓盐酸的存在 下，与丙烯醛反应生成紫色物质，在560nm下有吸收峰。因此，通过显色反应来检测所得 3-羟基丙醛的产量。经测定，突变前的罗伊氏乳杆菌发酵产3-羟基丙醛的量几乎为0,采 用本申请中的罗伊氏乳杆菌RSOl结合上述发酵方法，所得3-羟基丙醛的产量为2. 5-2.Sg/ L;而菌种的生长周期由原来的12-20h缩短至现在的5h，大大降低了生产成本，节约了水、 电、汽等能源。
[0041] 抑菌试验
[0042] 将实施例1中分离得到的发酵液稀释到四倍体积，按照以下步骤对发酵液的抑/ 杀菌（白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）能力进行测定：
[0043] -、配制培养基：配制营养琼脂培养基；
[0044] 二、灭菌：将步骤一配制的培养基、培养皿、牛津杯、移液枪枪头等放入灭菌锅中灭 菌；
[0045] 三、取适量活化好的致病菌接入冷却至40°C的培养基中，制得菌悬液；
[0046] 四、将步骤三中的菌悬液倒入培养皿中，待培养基凝固；
[0047] 五、在培养皿中放入牛津杯（每个平皿放3个），再于牛津杯中加入0.24ml待测样 品；
[0048] 六、将步骤五中的培养皿放入培养箱中培养12h;
[0049] 七、观察抑菌圈大小。
[0050] 抑菌效果根据抑菌圈大小来判断，标准如表1所示，所得结果见图3-5。
[0051] 表1抑菌效果判定标准
[0052]
[0053] 抑菌试验结果显示，本发明的发酵液抑制白色念珠菌所形成的抑菌圈直径为 26. 3_、抑制金黄色葡萄球菌所形成的抑菌圈直径为27. 8_、抑制大肠杆菌所形成的抑菌 圈直径为31. 2mm，结果均显著高于高度敏感的标准，采用以上方法验证稀释80倍体积的发 酵液的抑菌效果，发现发酵液稀释至80倍仍有抑菌效果，说明本发明的益生菌素高产菌株 的发酵液对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很强的杀灭作用。
[0054] 安全性试验
[0055] 为验证本发明益生菌素高产菌株的安全性，采用本发明的发酵液对SD系大鼠进 行灌胃和阴道注射，来研究本发明的益生菌素高产菌株代谢生产物对其血生化指标和阴道 组织的影响。
[0056] 取体重