产琼胶酶的需钠弧菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种产琼胶酶的需钠弧菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 琼胶（agar)是一种从海洋红藻中提取的多糖，在食品、医药、卫生等行业已有悠 久的应用历史，但由于其黏度高，水溶性低，不易被吸收，在应用方面受到一定的限制。琼胶 寡糖是琼胶经降解得到的聚合度2~10的低聚糖，又称琼胶低聚糖，主要由琼二糖的重复 单位连接而成，由于水溶性好，容易被人体吸收，因此其在医药领域具有较高的应用价值。 研究表明琼胶寡糖能够抑制血糖升高，提高人体免疫力，抗肿瘤，减少细胞的氧化损伤等， 是一种极具开发潜力的低聚糖。
[0003] 现有技术中制备琼胶寡糖的方法一般为酸降解法、衍生化降解法、氧化还原降解 法和酶解法。酸降解法制备琼胶寡糖，所得产物均一性较差，重复性差，反应条件需要高温 高压而存在安全隐患，且酸降解法不可避免地破坏糖的结构，导致琼胶寡糖生理生化活性 的丧失，此外酸降解法所使用的酸性物质会对周围生态环境造成严重污染；衍生化降解法 主要用于多糖的组分结构分析，在用于合成寡糖时，其过程复杂；氧化还原降解法是利用反 应中产生的羟基自由基使糖链发生非专一性的断裂，此方法的专一性差，无法重复，不利于 琼胶寡糖的制备；酶解法制备琼胶寡糖具有催化效率高、产物专一性好、反应条件温和、产 物易控制、无污染等诸多优势，但由于缺乏产酶活力高的菌株，导致琼胶酶产量低下，提高 了酶解法的生产成本，限制了该法的推广应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种产琼胶酶的需钠弧菌及其应用。
[0005] 本发明的具体技术方案如下：
[0006] 产琼胶酶的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l，该菌株保藏于中国典 型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072,保藏编号：CCTCCM 2015244,保藏日期：2015年4月23日。
[0007] 上述产琼胶酶的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l在制备琼胶酶中的应 用。具体包括如下步骤：
[0008] (1)将所述需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l接种于斜面培养基，于30~ 35°C下培养24~48h，进行活化；
[0009] (2)将活化后的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ-l接种于种子液体培养 基中，于30~35°C下培养8~24h，得到种子液；
[0010] (3)将种子液接种于液体产酶培养基中，于30~35°C下培养42-48h，得到含琼胶 酶的发酵液；
[0011] (4)将上述含琼胶酶的发酵液经离心除去菌体后，经硫酸铵沉淀分离，再透析，最 后冻干得琼胶酶粗酶粉末。
[0012] 在本发明的一个优选实施方案中，所述斜面培养基的配方为：琼脂15~20g/L，酵 母提取物I. 〇~2.Og/L，蛋白胨3. 0~5.Og/L，牛肉膏I. 0~2.Og/L，磷酸铁0. 01g/L，溶 剂为陈海水或合成海水，pH= 7. 4~7. 6。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，所述种子液体培养基的配方为：酵母提取物 I. 0~2.Og/L，蛋白胨3. 0~5.Og/L，牛肉膏I. 0~2.Og/L，磷酸铁0. 01g/L，溶剂为陈海水 或合成海水，pH= 7. 4~7. 6。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物 1. 0~2. 0g/L，蛋白胨3. 0~5. 0g/L，牛肉膏1. 0~2. 0g/L，磷酸铁0. 01g/L，溶剂为陈海水 或合成海水，pH= 7. 4~7. 6。
[0015] -种以新琼二糖为结构单元的新琼寡糖的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)将所述需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l接种于斜面培养基，于30~ 35°C下培养24~48h，进行活化；
[0017] (2)将活化后的需钠弧菌（VibrionatriegenS)HJPHYXJ-l接种于种子液体培养 基中，于30~35°C下培养8~24h，得到种子液；
[0018] (3)将种子液接种于液体产酶培养基中，于30~35°C下培养42_48h，得到含琼胶 酶的发酵液；
[0019] (4)将上述含琼胶酶的发酵液经离心除去菌体后，经硫酸铵沉淀分离，再透析，最 后冻干得琼胶酶粗酶粉末；
[0020] (5)以上述琼胶酶粗酶粉末为催化剂对琼胶进行酶解，酶解体系如下：上述琼胶 酶粗酶粉末浓度1~5 %，底物浓度0. 1~0. 5 %，酶解缓冲液为pH7. 0~7. 5的Tris-HCl 缓冲液，酶解温度40~45°C，酶解时间24~36h;
[0021] (6)将步骤（5)的酶解产物冷却后，离心过滤除去未被降解的琼胶，制得所述新 琼寡糖。
[0022] 在本发明的一个优选实施方案中，所述斜面培养基的配方为：琼脂15~20g/L，酵 母提取物1. 〇~2. 0g/L，蛋白胨3. 0~5. 0g/L，牛肉膏1. 0~2. 0g/L，磷酸铁0. 01g/L，溶 剂为陈海水或合成海水，pH= 7. 4~7. 6。
[0023] 在本发明的一个优选实施方案中，所述种子液体培养基的配方为：酵母提取物 1. 0~2. 0g/L，蛋白胨3. 0~5. 0g/L，牛肉膏1. 0~2. 0g/L，磷酸铁0. 01g/L，溶剂为陈海水 或合成海水，pH= 7. 4~7. 6。
[0024] 在本发明的一个优选实施方案中，所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物 1. 0~2. 0g/L，蛋白胨3. 0~5. 0g/L，牛肉膏1. 0~2. 0g/L，磷酸铁0. 01g/L，溶剂为陈海水 或合成海水，pH= 7. 4~7. 6。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1、本发明的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l经鉴定该菌为Vibrio natriegens，分离自福建省漳州市某紫菜养殖区的紫菜及其附近水域，属于革兰氏阴性菌， 好氧生长，最适生长NaCl浓度为2〇-25g/L，无需碳源加入；该菌生长周期短，培养4h后进 入对数生长期中期；
[0027] 2、本发明的需钠弧菌（VibrionatriegenS)HJPHYXJ-l产生的琼胶酶为胞外酶，分 离纯化简单，无需细胞破碎；
[0028] 3、本发明的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l的产酶活性比较高，在优选 条件下，未经过纯化的粗酶酶活力达到103U/mL;
[0029] 4、本发明的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l所产的琼胶酶降解琼胶需 要的反应条件温和，专一性好，对环境无污染；
[0030] 5、本发明的以新琼二糖为结构单元的新琼寡糖的制备方法简单，成本低，可用于 新琼寡糖的大量生产。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例1所筛选出的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ-l在 平板培养基上的菌落形态图；
[0032] 图2为本发明实施例1所筛选出的需钠弧菌（Vibrionatriegens)HJPHYXJ_l的 扫描电子显微镜下的菌体形态图；
[0033] 图3为本发明实施例4所制得的新琼寡糖的HPLC色谱图；
[0034] 图4为新琼寡糖标准品的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0035] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0036] 实施例1:产琼胶酶菌株的筛选
[0037] (1)将含1%。琼胶的2216E培养基50mL分装于250mL锥形瓶中，取少量有根紫菜 和无根紫菜（来自福建省漳州市某紫菜养殖区）剪碎，以无菌水振荡30min，然后将该振荡 液混合海水接种到富集培养基中，富集培养2~3代，使得目的菌株的数量增加。
[0038] (2)将含15%。琼胶的2216E培养基倒平板，将富集培养的菌液进行10 1~10 8逐 级稀释，将10 7、10 8两个稀释度的菌液涂平板，培养48h后用卢戈氏碘液染色观察（能够产 生琼胶酶的菌株能够降解琼胶，琼胶被降解后，不能被卢戈氏碘液染色，因此会产生明显的 透明圈），将能产生透明圈的菌株平板划线分离纯化，留待后续进一步复筛。
[0039] (3)用接种环分别挑取步骤⑵得到留待复筛的各个菌株的新鲜菌苔各2环，接 入液体产酶培养基中，于30°C、200r/min振荡条件下发酵培养40h后，将发酵液于1000 Or/ min下离心lOmin，过滤除菌，测酶活力，筛选出酶活力最高的菌株，保存于-80°C的冰箱中 备用，即为需钠弧菌HJPHYXJ-1。
[0040] 如图1所示，该菌的菌落特征如下：涂布或划线于平板培养基上生长迅速，30°C培 养24h后长出周边光滑、湿润、白色、直径约0. 5~0. 8cm的菌落，并且在固体平板或斜面培 养基边缘出现液化；
[0041] 如图2所示，该菌的菌体特征如下：直杆状，两端钝圆，大小为0. 3~0. 5X0. 8~ LOum;
[0042] 该菌的生理生化特征如下：革兰氏染色阴性；硝酸盐、脂酶、乙醇、纤维二糖、D-甘 露醇、D-半乳糖、乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、甘氨酸、L-脯氨酸阳性；精氨酸双水解酶、明胶酶、 L-酪氨酸、D-山梨醇、D-木糖阴性，具体参见下表：
[0043]
[0045] 所述的斜面培养基组成为：琼脂15~20g/L，酵母提取物I. 0~2. 0g，蛋白胨 3. 0~5. 0g，牛肉膏I. 0~2. 0g，磷酸铁0.Olg，溶剂为陈海水或合成海水，调pH= 7. 4~ 7. 6〇
[0046] 所述的摇瓶复筛产酶培养基组成为：酵母提取物I. 0~2. 0g，蛋白胨3. 0~5. 0g， 牛肉膏1. 0~2. 0g，磷酸铁0. 01g，溶剂为陈海水或合成海水，调pH = 7.4~7.6。
[0047] 上述合成海水配方如下：NaCl24. 00g，MgCl2?6H20 11. 00g，Na2SO4 4. 00g， CaCl? 6H20 2. 00g，KCl0? 70