一种耐有机溶剂高效转糖基β-半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株耐有机溶剂高效转糖基P-半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂 0 -半乳糖苷酶及其基因，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属 于生物制药技术领域。
【背景技术】
[0002] 核苷类药物是临床上用于治疗病毒性感染、肿瘤、艾滋病的一类重要药物。目前使 用的抗病毒药物中斤50 %是核苷类药物。作为抗病毒药物，它们通过干扰感染细胞中核酸 合成而使病毒复制收到抑制；作为抗肿瘤药物，它们通过干扰肿瘤细胞的DNA合成而起到 抑制肿瘤细胞的效果。但与其它许多药物相似，核苷类药物通常缺乏选择性，这不仅影响疗 效，还会对其它正常细胞产生毒副作用。
[0003]前药是指药物经过化学结构修饰后得到的无活性或活性较小、在体内经酶或非酶 转化释放出活性药物而发挥药效的化合物，主要是用来降低母药的毒性、提高稳定性、利用 度及选择性。目前前药设计主要是将一些基团或载体与母药共价结合，而在众多基团中，单 糖无疑是最具前景的。首先，单糖具有特定的生物活性，不会产生副作用；其次，单糖具有很 好的水溶性，它可以提高母药的水溶性及稳定性；更为重要的是，在人体内具有众多糖受体 及转运体，可以提高药物的选择性。
[0004] 糖基化是一类重要的改性修饰反应，不仅会改变化合物的水溶性、稳定性、在细胞 内的运输特性、亚细胞定位以及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。近年来， 糖科学和糖组学在国际学术界和新兴产业界均得到了高度关注。但是糖分子存在多个性质 相似的羟基，且糖苷键形成过程中还可能产生a-和两种异构体，因此传统化学法合成 糖苷类化合物存在着区域和立体选择性差、需要保护/脱保护等步骤、副产物多等缺点，特 别是复杂天然产物的糖基化反应目前利用化学手段较难实现。而用酶进行生物转化可弥补 化学合成法的选择性不足等缺陷，酶法糖基化通常具有高度的区域及立体专一性，然而常 规的酶法催化在水相中进行，而要修饰的核苷类药物、天然产物等均不溶于或难溶于水导 致产率及转化率低，成为糖苷类化合物合成的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可 以很好的克服底物水溶性差的问题，还可以对产物进行一定程度的调控。
[0005]目前有关核苷类药物酶法糖基化修饰的报道主要在水相中进行，不能克服修饰水 溶性较差的化合物时的低底物溶度、低转化率，且酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体 主要是邻硝基苯基-P-D-半乳糖苷（oNPG)或对硝基苯基-P-D-半乳糖苷（pNPG)，这些相 比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。
【发明内容】
[0006] 本发明针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化反应转 化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一株耐有机溶剂高效转糖基P-半 乳糖苷酶高产菌株，有机溶剂耐受性好、以乳糖为糖基供体的P-半乳糖苷酶，含有编码该 酶基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该P-半乳糖苷酶在核 苷类药物修饰中的应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，
[0008] -、本发明提供一株耐有机溶剂高效转糖基(6-半乳糖苷酶高产菌株，其属于巨 大芽孢杆菌属，命名为巨大芽孢杆菌YZ08(BacillusmegateriumYZ08)，已于2015年3月 5日保存于中国典型微生物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏登记号为CCTCC NO：M2015086〇
[0009] 本发明对巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumYZ08的生物学特征进行鉴定，该菌 株为革兰氏阳性菌株，有芽孢，好氧，最适生长温度为30~40 °C。其生理生化特性表现在： 液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝酸。
[0010] 经16SrDNA序列分析，该菌株鉴定为Bacillusmegaterium。
[0011] 二、本发明BacillusmegateriumYZ08菌株生产的半乳糖苷酶，其氨基酸序列表 如SEQIDNo:2所示。本发明的SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成的(6-半乳糖苷酶可 以从BacillusmegateriumYZ08中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中 分尚获得，也可以人工获得。
[0012] 三、本发明提供一种基因，其编码本发明BacillusmegateriumYZ08菌株生产的 半乳糖苷酶。优选地，其碱基序列如SEQIDNo:1所示。
[0013] 本发明SEQIDNo.1所示的核酸来源于BacillusmegateriumYZ08中分离获得， 也可以从含有该SEQIDNo:1所示的重组表达载体中或者重组表达转化体中分离获得，也 可以人工获得。
[0014] 本发明中，核苷酸序列如序列表SEQSEQIDNo:1所示，命名为gal，全长3105bp。 其编码序列（⑶S)从第一个碱基起至第3105个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA。其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo:2所示。
[0015] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQIDNo:2的氨基酸序列的 核苷酸序列不仅仅局限于SEQIDNo:1。本发明的(6-半乳糖苷酶基因的碱基序列也可以 是编码序列表中SEQIDNo:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。
[0016] 四、本发明提供一种重组表达载体，包含SEQIDNo:1所述的核苷酸序列。它可 以通过本领域常规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为 本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的， 可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶 BamHI和XhoI进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶 BamHI和XhoI双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的(6-半乳糖苷酶基因的重 组表达载体pET-gal。
[0017] 五、本发明提供一种重组表达转化体，包含上述的重组表达载体。优选地，重组表 达转化体为重组大肠埃希氏菌（E.coli)JM109 (DE3) /pET-gal。本发明将前述的重组表达载 体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可为本领域常规的各种宿主，只要能 满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的P_半乳糖苷酶基因可被有效 表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌（E.coli)JM109(DE3)。将前述重组 表达质粒pET-gal转化至（E.coli)JM109(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即 大肠埃希氏菌（E.coli)JM109(DE3)/pET_gal。
[0018] 六、本发明还提供一种重组P-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本 发明前述的重组表达转化体，获得重组表达的P_半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达 转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的P_半乳 糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7. 0。培养方 法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通 知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的P_半乳糖苷酶即可。 其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的 重组大肠杆菌JM109 (DE3)/pET-gal接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光 密度OD6。。达到0. 6-1. 0时，在终浓度为0. 1-1.Ommol/L的异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖 苷（IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组(6-半乳糖苷酶。
[0019] 本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可 以是上述产生的重组P_半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离 后得到的转化体细胞。
[0020] 七、本发明还提供一种本发明所述的P_半乳糖苷酶在催化乳糖和核苷类化合物 进行转糖基反应形成半乳糖基核苷类衍生物的应用。所述蛋白质在水相或非水相中以乳糖 为糖基供体合成半乳糖基核苷类衍生物。
[0021] 优选地，所述的应用以寡糖为糖基供体，在水相或非水相反应条件中进行；所述的 条件为：采用〇%或10%的亲水性有机溶剂，核苷类化合物的浓度为20~100mm〇l/L，乳糖 浓度为〇. 5mol/L，P-半乳糖苷酶的用量为0. 5U/mL，在pH5.0~9. 0的缓冲溶液中，35°C 反应3~9h。
[0022] 优选地，所述核苷类药物为叠氮胸苷、阿昔洛韦、拉米夫定、吉西他滨中任一种；所 述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙醇、DMS0、DMF中的一种或几种；优选地，所述非水相条件 为：采用10%的二甲基亚砜，20mM阿昔洛韦或IOOmM叠氮胸苷或IOOmM拉米夫定或IOOmM 吉西他滨，500mM乳糖为糖基供体，加入0.5U/mLP-半乳糖苷酶，在50mMpH7.4的磷酸缓冲 中，于35°C反应3-12h。
[0023] 本发明的有益效果在于：本发明针对目前生物法糖基化修饰核苷类药物的研究中 存在的糖基供体价格昂贵、部分底物水溶性差、产率及转化率低等问题，提供一种P_半乳 糖苷酶及利用重组P_半乳糖苷酶在非水相中修饰核苷类药物的应用。反应以廉价易得的 乳糖为糖基供体，在非水相体系中进行转糖基反应，成功克服了目前生物法糖基化修饰核 苷类药物存在的问题，具有很好的应用潜力。
【附图说明】
[0024] 图1为基因gal的PCR扩增电泳图，其中：1.DNAMarker;2~3?基因gal的PCR 扩增产物。
[0025] 图2为重组-半乳糖苷酶GAL的聚丙烯酰胺电泳图（1 :蛋白Marker;2 :粗酶； 3 :镍柱纯化后酶液；4 :切除His标签的纯酶）。
[0026] 图3为重组-半乳糖苷酶GAL的溶剂稳定性。
[0027]本发明的生物材料，巨大芽抱杆菌YZ08(BacillusmegateriumYZ08)，已于2015 年3月5日保存于中国典型微生物保藏中心（CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保 藏编号为CCTCCNO:M2015086。
【具体实施方式】
[0028] 实施例一
[0029] 本实施例说明半乳糖基化修饰核苷类药物的耐有机溶剂菌株的筛选程序。
[0030] 初筛采用如下方法：以X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷）为底物，将 本实验室耐有机溶剂菌库中的菌株接种至筛选平板，直接观察平板颜色变化，如果变为蓝 色，说明该菌株具有(6-半乳糖苷酶水解活性。具体筛选培养基配方为：乳糖l〇g/L，酵母膏 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，NaCl10g/L，MgSO4O. 5g/L，K2HP042. 5g/L，X-Gal0?lg/L，pH7. 0,琼 脂20g/L。培养温度为37°C，培养时间为12-36h。此方法可筛选到大量耐有机溶剂半 乳糖苷酶产生菌。
[0031] 将初筛获得的菌株进行复筛，具体方法如下：将初筛获得的菌株接种至产酶发酵 培养基，具体配方为：乳糖l〇