一种耐有机溶剂蛋白酶pt121或其突变体高效合成苄氧羰基阿斯巴甜的工艺的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及基因工程和生物催化工程研究领域，具体涉及一种耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体高效合成苄氧羰基阿斯巴甜的工艺。【
背景技术：
】[0002]近年来蛋白酶催化合成小分子化合物越来越受到人们的关注，其可进行小肽合成、糖轭合物、水凝胶分子自组装、转酯反应以及手性醇动力学拆分等，在医药中间体、化妆品、日用品、生物材料等领域具有广泛的应用前景。然而大多数耐有机溶剂蛋白酶的催化效率不是很高，所以，筛选出具有高催化效率的蛋白酶的对于蛋白酶在非水相或者水相催化在工业上的发展与应用具有突出的意义。[0003]阿斯巴甜是由L型天冬氨酸和L型苯丙氨酸甲酯缩合而成的一种二肽甲酯化合物，是一种人工合成的甜味剂。阿斯巴甜的甜味大约是蔗糖的200倍，在甜味剂的添加方面具有很广的应用范围。MagnusonBA等（CriticalReviewsinToxicological37(8):629-727)研究了阿斯巴甜的药理学毒性，研究表明在目前的食品添加范围内阿斯巴甜对人体是非常安全的。[0004]目前报道的阿斯巴甜主要通过两种方法来合成，化学法、酶与化学法混合。在化学法的合成中具有很大的弊端，需要对天冬氨酸的氨基和0-羧基进行保护，并且还需要对羧基进行活化处理，反应的过程中伴随着少量的0位副产物以及少量由于消旋作用产生的D型副产物，由于D型阿斯巴甜具有苦味，所以在后期还需要对副产物进行分离。在进行氨基酸保护和脱保护的过程中影响产物的总收率，整个过程步骤繁琐，污水排放严重。[0005]采用嗜热蛋白酶或者嗜热蛋白酶与化学法结合的方法生产阿斯巴甜，能够利用3位未保护的苄氧羰基天冬氨酸高产率的生产出不含0型副产物的a型阿斯巴甜，并且没有消旋作用产生的D型产物。由于蛋白酶具有特殊的催化位点选择性，所以能生产出完全不含0型副产物的阿斯巴甜。然而酶法这项技术也有很大的缺点，日本专利JP60118190在使用嗜热蛋白酶合成阿斯巴甜的过程中，反应体系采用双相法高效的合成阿斯巴甜前体，将反应生成的产物相转移至有机相。这一反应工艺在底物和产物在两相中的分配难以把握，而且转移至有机相中的产物的后分离的过程中能源浪费较大。[0006]在合成阿斯巴甜前体(苄氧羰基阿斯巴甜）的过程中，底物对酶的抑制性很明显，底物的浓度相对较低。在工业化应用方面有一定的难度。HiroyasuOgino等（"Enhancementoftheaspartameprecursorsyntheticactivityofanorganicsolvent-stableprotease"，ProteinEngineering,Design&Selectionvol.23no.3pp.147-152，2010)开发的耐有机溶剂蛋白酶PST-01在催化合成阿斯巴甜前体时苄氧羰基天冬氨酸(Cbz-Asp)的最佳浓度为30mM，苯丙氨酸甲酯（PheOMe)的最佳浓度为500mM，节氧羰基阿斯巴甜（Cbz-APM)的产率达到83%，此工艺反应体系中的苄氧羰基天冬氨酸的浓度低，其底物的摩尔比不经济，且在反应体系中使用了百分之五十的DMS0,产物与底物均溶于溶液中导致繁杂的后分离等步骤，难以实现酶法工业化生产阿斯巴甜。[0007]美国专利US2012/0295294采用耐有机溶剂蛋白酶PT121合成阿斯巴甜，该专利在合成阿斯巴甜的过程中使用非保护天冬氨酸，两底物的摩尔比为1:20,但是底物投入量高产率仅为30.8%，形成了底物的大量浪费，产物在有机相中分离难度大，其产业化的价值低。[0008]有鉴于现有工艺的不足，特提出本发明。【
发明内容】[0009]本发明的第一目的在于对本发明人团队在先授权专利的来自于Aeyt/offioaasaerwgiflosa耐有机溶剂蛋白酶PT121进行定向的进化，以得到具有更高催化效率的蛋白酶并提供一种化学酶法高效率经济合成阿斯巴甜的工艺，采用蛋白酶PT121或其突变体催化合成阿斯巴甜前体（Cbz-APM)的反应分离耦合工艺，能够很好地解决了底物抑制性，底物的利用率及产物的后期分离等问题。[0010]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体高效合成苄氧羰基阿斯巴甜的工艺，具体为耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体催化苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯或其盐酸盐酶法合成苄氧羰基阿斯巴甜。[0011]本发明所述的工艺，所述耐有机溶剂蛋白酶PT121的突变体为Y114S、K191Y、Y114S/K191Y。本发明所述的工艺，酶法合成的反应体系中pH值为4-8,优选pH值为5-7，更优选pH值为6。[0012]其中，苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯或其盐酸盐的反应摩尔比为1:10-1:1，优选1:5-1:1，更优选1:1;所述耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体的用量为200-5000U/mL，优选2000-4000U/mL。[0013]其中，更优选首次投料两底物的摩尔比为1:5,后续投料摩尔比使得反应体系中摩尔比为1:5,其过量底物的循环利用可达到首次投料摩尔比为1:5的同样的反应效率，所以能够达到实际的底物比为1:1，无过量的苯丙氨酸甲酯盐酸盐(苯丙氨酸甲酯）损失的最终目的。[0014]本发明所述的工艺，苄氧羰基天冬氨酸（Cbz-Asp)浓度为30-200mM为宜，反应效率较高的浓度为l〇〇mM，苯丙氨酸甲酯盐酸盐（PheOMe.HCl)或苯丙氨酸甲酯（PheOMe)浓度为150-600mM，较经济且反应效率较高的浓度为500mM。[0015]本发明所述的工艺，所述酶法合成在有机溶剂和/或水相中进行，所述有机溶剂选自乙醇、DMS0、甲醇、DMF、乙酸乙酯或甘油中的一种，优选DMS0、甲醇或者乙醇；当酶法合成在有机溶剂和水相的混合液中进行时，有机溶剂在混合液中的体积浓度（v/v)为0%-40%;优选0%-20%，更优选0%。[0016]本发明所述的工艺，所述酶法合成反应温度为10-50°c，优选25°C-40°c，更优选37°C;反应时间为6-24h，优选12h。[0017]本发明所述的工艺，产物从反应体系中直接析出；优选析出后采用抽滤的方法分离产物，并将溶于反应液中过剩的原料用于循环再利用，并再投料，即可实现批次苄氧羰基阿斯巴甜的合成。[0018]本发明所述的工艺，合成后的产物苄氧羰基阿斯巴甜采用采用pH=10的水溶液溶解，然后用稀盐酸调节体系的pH=5或者5以下，或者采用pH=5或者5以下的水溶液洗涤，进一步纯化生成的产物，真空干燥即得纯度为99%以上的苄氧羰基阿斯巴甜。[0019]本发明的有益效果在于使用来自于aer收PT121(CCTCCM208029)的耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体(优选其突变体）高效催化苄氧羰基保护的天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯合成阿斯巴甜前体苄氧羰基保护的阿斯巴甜（Cbz-APM)。并对其各个条件进行了优化，并筛选出了适合于使用酶法苄氧羰基阿斯巴甜生产的条件。[0020]具体而言，本发明通过定向进化技术对铜绿假单胞菌来源的耐有机溶剂蛋白酶PT121基因（见中国专利CN101240254B)进行分子改造，使改造后的蛋白酶的突变体在合成阿斯巴甜前体时具有更优良的性能。该耐有机溶剂蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQIDN〇:l表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQIDN〇:l中的：第114位，和/或第191位；其在合成阿斯巴甜前体时比原出发蛋白酶大大提高当前第1页1 2 3