。其中，所述的SEQ IDNo:l是中国专利CN101240254B中所述的铜绿假单胞菌aer收"ifliosa) PT121所产的蛋白酶的成熟肽部分，编码301个氨基酸。
[0021] 进一步地，所述的蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代所述的氨基酸残 基位置为SEQIDNo: 1中的：第114位，和/或第191位；其在合成阿斯巴甜前体比原出发 蛋白酶大大提
[0022] 更进一步地，所述的蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQID No: 1 (中国专利CN101240254B)表示的氨基酸序列表现出至少99%同源性的氨基酸序列 的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨 基酸残基位置为SEQIDNo: 1中的：第114位，和/或第191位；其在合成阿斯巴甜前体比 原出发蛋白酶大大提高。
[0023] 更进一步地，所述的另一种氨基酸残基优选自下述的氨基酸：第114位：丝氨酸 (氨基酸缩写名称为S);第191位：酪氨酸(氨基酸缩写名称为Y)。
[0024] 编码本发明所述的蛋白酶突变体的基因，其出发蛋白酶的基因序列参见在先授权 中国专利CN101240254B所对应的蛋白酶成熟肽段编码的核苷酸序列。在该蛋白酶的第 114位和第191位突变点对应的编码的核苷酸编码，另理解为本发明所述的"另一种氨基酸 残基"所编码的核苷酸编码。
[0025] 本发明所述的重组载体，应理解为现有技术中任意的基因的重组载体，例如各种 质粒，即将蛋白酶突变体的突变基因导入能使该蛋白酶突变体稳定的表达DNA载体质粒。
[0026] 而所述的重组载体的转化体，即指重组载体的宿主细胞，例如，本发明实施例2所 述的微生物凡cWiBL21的宿主细胞；当然，现有技术常用的宿主细胞的微生物包括革兰 氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵 母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。
【附图说明】
[0027] 图1耐有机溶剂蛋白酶PT121突变体蛋白电泳图，其中，1为Marker; 2为Y114S; 3为K191Y; 4为Y114S/K191Y; 图2为阿斯巴甜合成反应路线示意图； 图3为耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体催化合成产物阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯 巴甜的HPLC图谱； 图4为苄氧羰基阿斯巴甜（Cbz-APM)的质谱图，由上海吉尔生化试剂有限公司提供，纯 度为99. 8% ; 图5为实施例4所得苄氧羰基阿斯巴甜（Cbz-APM)实验产物的质谱图。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明： 本发明采用化学和生物相结合的方法合成阿斯巴甜，采用领域内大家公知的化学法从 天冬氨酸和苯丙氨酸出发合成苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯或其盐酸盐，在酶催化的 过程中采用苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯或其盐酸盐在有机溶剂或者非有机溶剂中 酶法催化合成苄氧羰基保护的阿斯巴甜（Cbz-APM)，由于实现了反应分离耦合，反应效率 高，过剩原料存在于溶液中，高纯度产物从体系中析出产品单一，无副产物。
[0029] 本发明所述的耐有机溶剂蛋白酶PT121来自于aerwgiflosa，并 且该耐有机溶剂蛋白酶PT121已经公开在同一发明人的在先授权专利(授权公告号： CN101240254B)。
[0030] 此外，本发明涉及到耐有机溶剂蛋白酶PT121突变体的应用，利用PCR技术对耐有 机溶剂蛋白酶PT121的部分氨基酸进行突变，获得具有催化活性的蛋白酶突变体。
[0031] 本发明将上述突变后的蛋白酶PT121进行了催化合成苄氧羰基阿斯巴甜 (Cbz-APM)的能力的检测，发现突变后的耐有机溶剂蛋白酶PT121突变体在催化合成苄氧 羰基阿斯巴甜时，在相同的条件下，高于未突变的蛋白酶PT121的合成能力。
[0032] 使用本发明所述的铜绿假单胞杆菌aerygifliosaPT121所产的耐有 机溶剂蛋白酶PT121产生菌，耐有机溶剂蛋白酶PT121突变体，在大肠杆菌或枯草杆菌及酵 母重组表达酶能高效催化合成苄氧羰基阿斯巴甜，降低了在生产阿斯巴甜的过程中所带来 的污染，实现了底物、产物以及酶的完全分离并实现了底物的全利用，为酶法生产阿斯巴甜 提供了高效的酶源，为实现绿色生产阿斯巴甜提供了关键性的技术与催化剂。
[0033] 本发明使用所述的耐有机溶剂蛋白酶PT121突变体在枯草杆菌或者酵母及大肠 杆菌中重组表达产物，在水相或者非水相中高效催化合成苄氧羰基阿斯巴甜（Cbz-APM)。
[0034] 本发明提供了耐有机溶剂蛋白酶PT121突变体在水相或非水相中催化苄氧羰基 天冬氨酸（Cbz-Asp)和苯丙氨酸甲酯（PheOMe)或其盐酸盐（PheOMe.HC1)合成节氧羰基阿 斯巴甜（Cbz-APM)的应用。
[0035] 其中，酶法合成的反应体系中pH值为4-8,优选pH值为5-7,更优选pH值为6。发 明人在实际研究过程中发现，体系pH值的范围直接影响到底物和产物在反应体系中的溶 解度，合理的pH值有利于提高底物的溶解度和降低产物的溶解度，从而能够更好的实现反 应分离耦合的工艺。
[0036] 其中，苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯或其盐酸盐的反应摩尔比为1:10-1: 1， 优选1:5。
[0037] 具体而言，反应体系中两底物的最优浓度：苄氧羰基天冬氨酸（Cbz-Asp)浓度为 30-200mM，反应效率较高的浓度为100mM，苯丙氨酸甲酯盐酸盐（PheOMe.HC1)或苯丙氨酸 甲酯（PheOMe)浓度为150-600mM，较经济且反应效率较高的浓度为500mM。并且在反应过 程中过量的底物可以直接循环利用。此外，首次投料两底物的摩尔比为1:5,后续投料摩尔 比为1:1，其过量底物的循环利用可达到首次投料摩尔比为1:5的同样的反应效率，所以能 够达到实际的底物比为1:1，无过量的苯丙氨酸甲酯盐酸盐(苯丙氨酸甲酯）的损失。
[0038] 本发明所述耐有机溶剂蛋白酶PT121或其突变体的用量为200_5000U/mL，优选 2000-4000U/mL。
[0039] 本发明所述酶法合成在有机溶剂和/或水相中进行，所述有机溶剂选自乙醇、 DMS0、甲醇、DMF、乙酸乙酯或甘油中的一种，优选DMS0、甲醇或者乙醇；当酶法合成在有机 溶剂和水相的混合液中进行时，有机溶剂在混合液中的体积浓度（v/V)为0%_40%;优选 0%-20%，更优选0%。采用上述溶剂，能够促进底物的溶解，并促进反应向合成的方向进行，减 少合成所需的时间。溶剂的用量选择为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定。
[0040] 本发明所述酶法合成反应温度为15-50°c，优选25°C-40°c，更优选37°C。在 25-40°C下蛋白酶PT121突变体具有较好的热稳定性，催化完全酶活损失小。利于蛋白酶 PT121的重复使用。
[0041] 常规阿斯巴甜的合成工艺中，阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜由于底物和产物均 溶于溶剂体系中，并且存在消旋和0位羧基的副反应通常需要利用柱层析来实现分离。分 离所需时间长成本高。而采用本发明所述的工艺，所述步骤4酶法合成阿斯巴甜前体苄氧 羰基阿斯巴甜时，产物从反应体系中直接析出无副产物；优选析出后采用抽滤的方法分离 产物，并将溶于反应液中过剩的原料用于循环再利用。
[0042] 此外，本发明所述的工艺，产物苄氧羰基阿斯巴甜采用pH=10的水溶液溶解，然后 用稀盐酸调节体系的pH=6或者6以下，或者采用pH=6或者6以下的水溶液洗漆，进一步纯 化生成的产物，真空干燥即得，收率达到90%以上。该步骤可以进一步纯化生成的产物，使 得产物的纯度达到99. 8%，为下一步加氢还原提供更纯的底物。
[0043] 本发明采用原料补加技术使最终反应的两底物浓度摩尔比为