一种具有清除自由基功能的小分子多肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽领域，具体涉及了一种具有清除自由基功能的小分子多肽。
【背景技术】
[0002] 能将自由基还原为非自由基的氧化剂称为自由基清除剂。自由基清除剂是指具有 延迟、抑制和阻断ROS(活性氧）/OFR(氧自由基）氧化损伤的物质的总称，是能够与OFR结 合并使之清除的机体保护剂。因此，在机体正常过程中以及保护细胞和组织免受氧化损伤 中具有重要作用。目前，酶类和多肽类的自由基清除剂越来越受到人们的关注。
[0003] 现代医学研宄表明，蚯蚓具有抗血栓、平喘、皮肤修复、抑菌、抗氧化等多种生理功 能，通常以煎煮所得提取物或蚯蚓粉直接入药，或以提取纯化的纤溶蛋白用于治疗血栓等 疾病。蚯蚓是一种新型的高蛋白质源，蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，利用蚯蚓自溶、或外 源蛋白酶降解，所获得的蚯蚓蛋白酶解产物，具有多种生理活性功能，且清除自由基功效显 著。
[0004] 具体而言，专利文献CN103845272A提供了一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取 物的制备方法，其将干净蚯蚓捣碎或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液，蚯蚓 样品液利用自身酶或外加蛋白酶水解，得到蚯蚓水解液，将蚯蚓水解液经截留分子量小于 等于3万道尔顿的超滤膜超滤并冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。专利文献CN103845273A提 供了一种抗皮肤老化的地龙肽的制备的方法，其将蚯蚓样品液利用自有酶或加入蛋白酶水 解，再将水解液采用膜过滤和膜截留，冷冻干燥得到地龙肽，得到的地龙肽应用在抗皮肤老 化化妆品或保健品中。
[0005] 然而，现有技术公开的技术方案中，多肽的分子量均一性差，将多肽进行过滤或超 滤等后处理后，会造成大量活性多肽的损失，影响其清除自由基功能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的克服现有技术的缺陷，提供一种以蚯蚓为原料，采用混合多步酶解 法制备而成的小分子多肽，所述多肽具有优异的清除自由基功效。
[0007] 本发明提供了一种具有清除自由基功能的小分子多肽，所述小分子多肽以蚯蚓为 原料，由包括以下步骤的方法提取得到：
[0008] 1)将蚯蚓浸泡于浓度0. 1?5%的甲基纤维素溶液中，排净沙土后，将蚯蚓清洗干 净后，浸泡于纯净水中，分散成匀浆液；
[0009] 2)在步骤1)所得匀衆液中加入盐酸，使其浓度为0. 2?0. 4%，再加入胃蛋白酶， 36?38 °C下充分酶解后，得胃蛋白酶解液；
[0010] 3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 7?6. 9,加入中性蛋白酶，48? 52°C下充分酶解后，得中性蛋白酶解液；
[0011] 4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入菠萝蛋白酶，54?56°C下 充分酶解后，得菠萝蛋白酶解液；升温至88?92°C使酶灭活，得酶解液；
[0012] 5)将步骤4)所得酶解液用0. 4?0. 5ym的滤膜抽滤，再用截留分子量量为4-5kD 的超滤膜超滤，所得滤液脱苦脱色，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。
[0013] 本发明步骤1)中使用甲基纤维素溶液浸泡蚯蚓，甲基纤维素可以促进蚯蚓的肠 道蠕动，可以高效、快速的清除蚯蚓体内的沙土和废物，大幅度缩短蚯蚓清洗、浸泡的时间。 具体的，所述甲基纤维素溶液的浓度优选为0. 5?2%;蚯蚓与甲基纤维素溶液的质量体 积比为1 :1?10,优选为1 :2?5,此处4丘蚓的质量单位为g，甲基纤维素溶液的体积单位 为ml;虫丘蚓在甲基纤维素中浸泡的时间应足以将其体内沙土排除干净，浸泡的时间优选为 10?90min，进一步优选为30?60min;沙土排除干净后，用清水将4丘蝴通体清洗至少三 次，彻底将沙土、废物和甲基纤维素溶液的残留清洗干净。
[0014] 所述步骤1)中，艇蚓与纯净水的质量体积比为1 :1?20,优选为1 :3?5,此处虫丘 蚓的质量单位为g，纯净水的体积单位为ml;将蚯蚓分散成匀浆液的设备选用常规的高速 剪切机，高速剪切机的操作温度为-5?20°C，优选为0?4°C，转速为300?12000rpm，优 选为6000?8000rpm，剪切时间为0? 5?20min，优选为3?lOmin。
[0015] 本发明步骤2)中，所述盐酸的浓度为加入盐酸后的溶液的终浓度，所述百分比为 盐酸与溶液的质量体积比，优选为〇. 4%，;所述胃蛋白酶的比活为2500?4000U/g，其加入 量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇. 3?0. 5% ;胃蛋白酶解反应的温度优选为37°C，酶解反应 应充分，时间优选为2?5h。
[0016] 本发明步骤3)中，所述中性蛋白酶的比活为30000?60000U/g，其加入量为步骤 1)所述蚯蚓质量的0. 4?0. 8%;中性蛋白酶解反应的pH值优选为6. 8,温度优选为50°C， 酶解反应应充分，时间优选为2?3h。
[0017] 本发明步骤4)中，所述菠萝蛋白酶的比活为400000?800000U/g，其加入量为步 骤1)所述蚯蚓质量的〇. 5?1. 5%;菠萝蛋白酶解反应温度优选为55°C，酶解反应应充分， 时间优选为3?5h;酶灭活的温度优选为90°C，保持时间不宜过长或过短，为了保证酶被灭 活的同时减小多肽的失活，保持时间优选为10?20min，进一步优选为15min。
[0018] 本发明步骤5)中，所述脱苦脱色的具体步骤为：所得滤液中加入活性炭，室温低 速搅拌1?3h后，过滤除去活性炭即可。
[0019] 本发明步骤5)中依次经过过滤和超滤可以获得小分子的多肽，从免疫学角度出 发，小分子肽抗原性差，只能诱导机体产生很弱的免疫反应，在不经载体偶联的情况下即会 失去免疫原性，最大程度地减少多肽的致敏性，从而提高其应用时的安全性。
[0020] 作为优选方案，本发明所述小分子多肽由包括以下步骤的方法制备而成：
[0021] 1)将蚯弼丨浸泡于质量体积比1:2的0. 5%甲基纤维素溶液中，30min后，将蚯蚓清 洗干净后，浸泡于质量体积比1:3的纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切3min， 得匀浆液；
[0022] 2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0. 4%，再加入比活为3500U/ g的胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蝴质量的〇. 3%，37°C下反应3h，得胃 蛋白酶解液；
[0023] 3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 8,加入比活为50000U/g的中性蛋 白酶，所述中性蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇. 5 %，50°C下反应2h，得中性蛋白 酶解液；
[0024] 4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝 蛋白酶，所述菠萝蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇.8%，55°C下反应5h，得菠萝蛋 白酶解液；升温至90°C，保持15min，使酶灭活，得酶解液；
[0025] 5)将步骤4)所得酶解液用0. 45ym的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜 超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌2h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥， 即得小分子多肽。
[0026] 为了保证制备得到的小分子多肽的活性，除了酶解反应对温度的特别要求外，本 发明各个步骤的操作温度均优选为〇?4°c。
[0027] 本发明进一步保护所述小分子多肽在制备化妆品、食品、保健品、药品中的应用。
[0028] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案可以取得显著的效果。本发明提供的方 法原料来源广泛，且操作简单，制备得到的小分子多肽具有良好的自由基清除功效，无异 味、不致敏，可广泛应用于化妆品、食品、保健品、药品中。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 小分子多肽按照以下步骤制备而成：
[0032] 1)将100g蚯蚓浸泡于200ml浓度0. 5%的甲基纤维素溶液中，30min后，将蚯蚓清 洗干净后，浸泡于300ml纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切3min，得匀浆液；
[0033] 2)在步骤1)所得匀衆液中加入盐酸，使其终浓度为0. 4%，再加入比活为3500U/ g的胃蛋白酶〇. 3g，37°C下反应3h，得胃蛋白酶解液；
[0034] 3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 8,加入比活为50000U/g的中性蛋 白酶0. 5g，50°C下反应2h，得中性蛋白酶解液；
[0035] 4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝 蛋白酶0. 8g，55°C下反应5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至90°C，保持15min，使酶灭活，得酶 解液；
[0036] 5)将步骤4)所得酶解液用0. 45ym的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜 超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌2h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥， 即得小分子多肽。
[0037] 实施例2
[0038] 小分子多肽按照以下步骤制备而成：
[0039] 1)将100g蚯蚓浸泡于300ml浓度1%的甲基纤维素溶液中，45min后，将蚯蚓清洗 干净后，浸泡于200ml纯净水中，用高速剪切机在8000rpm条件下剪切3min，得匀浆液； [0040] 2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓