用于确定受试者对以自由基引起的dna损伤为特征的疾病状态的倾向的方法和分析产品的制作方法
【专利说明】用于确定受试者对以自由基引起的DNA损伤为特征的疾病状态的倾向的方法和分析产品
[0001]本发明涉及确定自由基引起的DNA损伤的方法。更具体地涉及确定受试者对以自由基引起的DNA损伤为特征的癌症或其他疾病状态诸如COPD或哮喘的倾向的方法。
[0002]本发明还涉及确定受试者与某些癌症有关的当前状态。
[0003]本发明还涉及确定受试者对电磁(EM)辐射引起的细胞损伤的敏感性的方法。具体地，本发明涉及确定受试者对紫外辐射(UV)引起的细胞损伤的敏感性的方法。
[0004]本发明还涉及用于实施本发明的方法的分析产品或相关试剂盒。
[0005]对细胞的氧化DNA损伤是细胞代谢的不可避免的结果；但是，与外源性起因诸如致癌化合物、氧化还原循环药物、电离和UV辐射互作也促进氧化损伤。
[0006]UV可被用作物理通用诱变因素以体外引起DNA损伤。与化学基因毒素相比，利用UVA光的优势是暴露时间的精确设定。化学基因毒素要求通过离心和洗涤步骤来移除。
[0007]UVA是太阳光的部分，太阳光在海平面的电磁波谱(290-5000nm)不仅包括可见的(56% )和红外区的(39% )部分，还包括紫外(UV)光(5% )。大部分的UVA(320-400nm)以及由于大气吸收而至更小程度的UVB (290-320nm)到达地球表面，而杀菌的UVC部分被完全地过滤掉。UVA/UVB光曾普遍地被描述为环境的人类致癌物质，也是红斑(太阳晒伤)、晒黑、光老化和免疫抑制的原因。但是，人工UV来源，主要地发射UVA，也在晒黑工作室(tanning stud1s)以及用于银肩病的治疗中被发现。在组织中UVA的吸收导致活性氧和氮物质以及不稳定铁的生成，其可转而伤害其他生物分子诸如DNA。UV暴露后最常见的DNA损伤类型是主要由临界量的UVB促进的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)，而UVA引起的氧化DNA损伤像8-oxolO鸟嘌呤取决于存在于细胞中的非DNA发色团。
[0008]UV吸收生成通过一系列的光产物的生成来引起DNA损伤的氧衍生自由基。这个过程可改变正常DNA的碱基配对能力，导致突变。正是这些突变可引起癌症，因为它们破坏肿瘤抑制基因诸如P53、和INK4A。自由基在很多类型的癌症中发挥作用。有证据表明，ATM(毛细血管扩张性共济失调突变)和ATR(Rad3相关的)基因的自由基相关突变在淋巴瘤的生成中发挥作用。
[0009]在过去的大约二十年，彗星实验(Comet assay)、或单细胞凝胶电泳实验已变成通过评价在细胞中的DNA链断裂来评估DNA损伤的标准方法之一。将包埋在显微镜载玻片上的琼脂糖中的细胞用去污剂和高盐浓度裂解以形成包含连接至核基质的DNA的超螺旋环的类核。
[0010]在高pH下的电泳引起通过荧光显微术观察到的像彗星的结构，其中彗星的尾巴相对于头部的强度反映DNA链断裂的数目以及碱不稳定位点。含有断裂的环失去其超螺旋并自由地向正极移动。因此彗星实验提供了确定基因组损伤的手段。
[0011]可通过利用成像软件手工打分来进行荧光的计算以确定DNA损伤的程度。
[0012]最近已发现癌症自身并且最可能地其癌前状态可导致对整个生物体的应激。然后这个事实可导致在对细胞中与癌症无关的外源性基因毒性损害的敏感性上的不同。归因于环境应激物或生活方式因素的损害可随后地在敏感细胞中引起更高的损伤。
[0013]以前，发明人曾使用传统的彗星试验及其新的变化形式(例如参见W02008/050134)作为针对皮肤的模型以确定测试物质诸如防晒霜(sun screen)保护细胞免受UV损伤的能力。但是，这种方法要求显著的预处理步骤如需要样品为淋巴细胞的形式。而且，淋巴细胞样品层用一种(针对传统的彗星实验)或更多种(针对新颖的3D实验)另外的屏障层覆盖以提供将样品包在内部的三明治效应。这导致相当地费力的过程。
[0014]提供确定细胞对电磁辐射的敏感度的改良的方法是期望的。确定受试者是否对以DNA损伤为特征的癌症或其它疾病具有倾向是期望的。
[0015]根据本发明的一方面，本发明提供了筛查受试者对以DNA损伤为特征的疾病的倾向的方法，包括以下步骤:
[0016]从受试者获取全血；
[0017]将所述全血的多个样品封固在基底上；
[0018]将样品暴露至电磁辐射的不同水平或强度；
[0019]检测在每个样品中的遗传损伤水平；以及
[0020]将损伤水平与预先确定的值或值的模式比较。
[0021]优选地筛查方法包括最后步骤:
[0022]从所述比较确定相关诊断结果。
[0023]本发明显示了比现有技术的方法在多个组之间更明确的分离。其还允许结果的更好的再现性。
[0024]优选地将每个样品暴露至不同水平的电磁辐射的步骤通过改变辐射源和样品之间的距离以产生针对每个样品的正确强度来进行。
[0025]所述多个样品可作为单个样品取自受试者，只要其可被分成用于测试是多个样品O
[0026]优选地将样品暴露至电磁福射10分钟至30分钟。
[0027]最优选地将样品暴露至电磁福射15分钟。
[0028]任选地，通过调整高度来改变发射的电磁辐射的水平，进行将样品暴露至不同水平的电磁辐射的步骤。
[0029]最优选地，在样品和电磁辐射源之间不放置另外的屏障材料层。
[0030]最优选地，在样品的顶部不直接放置另外的屏障材料层。
[0031]优选地，全血包括外周全血。
[0032]能使用全血而不需要显著的预处理步骤是特别的优势。
[0033]优选地，在将样品暴露至不同水平的电磁辐射之前，方法包括以下步骤:
[0034]将全血封固在基底上。
[0035]为了将全血样品封固在基底上，典型地将40 μ I稀释的全血与等量的细胞培养基(RPMI)和10% DMSO(贮存和冷冻介质)混合，并且将这与100 μ I 0.5%低熔点琼脂糖?400C )混合并施加到干燥的琼脂糖包被的载玻片。
[0036]设想35 μ 1、40 μ I或45 μ I血液会是优选的体积。在这些情况下细胞数目根据血液体积会分别是7-10、10-15或20-25个细胞。细胞密度根据血液体积会分别是0.0015、0.0020 或 0.0030。
[0037]最优选地，封固介质(mounting medium)是0.5%低恪点琼脂糖(<40°C )。
[0038]优选地EM辐射是UV辐射。
[0039]由于样品被提供与在基底上而不在上方提供任何另外的屏障层，在全血细胞被暴露至EM辐射后裂解其是可能的，因此移除对费力的预处理步骤的需要。
[0040]裂解后，方法还可包括以下步骤:
[0041 ] 移除包含红血细胞和碎片的裂解溶液。
[0042]方法可被用于筛查受试者对癌症包括但不局限于皮肤癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、前列腺癌、结肠-直肠癌的倾向。
[0043]方法还可被用于筛查受试者对COPD、哮喘、肺气肿或结肠息肉病的倾向。
[0044]为了提供对本发明的更好的理解，将参考以下图描述实施方案，其中:
[0045]图1是利用本发明的方法从实施例获得的数据的图解表示，显示了在不同的UV光高度(即在改变样品和UV源之间的不同距离，导致不同的强度)下的细胞的olive尾矩值(olive tail moments)并显示了在健康对照、癌前状态和癌症之间在图谱上的差异。
[0046]图2是利用如在文献中发表的标准正常(常规)彗星实验方法使用多种UV光高度获得的数据的图解表示。值得注意地，这里的图谱不同于利用新方法获得的图谱。
[0047]细胞对一种物理通用诱变因素即UV的不同响应已被发明者发明人发现以提供受试者对癌症的倾向的精确指示。本发明提供了用于针对在样品中的细胞对UV的敏感度测试样品并利用该结果以提供受试者对癌症的倾向的精确指示的简单且精确的方法。
[0048]第一步是从患者获得一个样品或多个样品。例如，通过静脉穿刺可容易地从受试者收集外周全血样品。样品(其可源自已被适当地分开的取自受试者的单个血液样品，已被适当地分开)可被用于以下分析方法(通常利用分析产品或相关试剂盒)。
[0049]优选的方法(基于UVA、全血和修改的标准彗星实验方法，即新实验)
[0050]用1%琼脂糖(正常熔点琼脂糖)包被要被使用的来自BDH(Superfrose TM)的载玻片。所有其它化学试剂从在 UK 的 VWR Internat1nal laboratories supplier address获得。
[0051]将40 μ I稀释的全血连同等量的RPMI和10% DMSO (贮存和冷冻介质)与100 μ I0.5%低熔点琼脂糖(<40°C )混合并施加到干燥的琼脂糖包被的载玻片。
[0052]与在标准彗星实验中三个层形成“三明治”不同，不需要第二个LMP琼脂糖层。只要将载玻片放在冰上5分钟然后其准备好用于UVA处理。
[0053]对于UVA暴露，使用装配有两个