一种通过自由基攻击微小rna造成rna氧化损伤的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种通过自由基攻击微小RNA造成RNA氧化损伤的方法，属于生物应 用技术领域。
【背景技术】：
[0002] 目前，氧化应激（oxidativestress)状态下细胞凋亡的分子机制是自由基和氧化 损伤学说的核心问题。非编码的小核苷酸分子--微小RNA(microRNA，miRNA)是近几年新 发现的一类长约22nt(19-25nt)在进化方面属保守的非编码RNA，这种小分子RNA通过互 补配对原则作用于mRNA，由此影响蛋白翻译过程引起基因沉默，其作用体现为在转录后水 平对基因表达进行调控。目前，越来越多的证据表明miRNA在多种生物学进程中的关键作 用，并且miRNA已经成为生命科学研宄的重要工具和多种疾病治疗的新手段。研宄表明RNA 比DNA和蛋白质更容易受到活性氧簇（R0S)的攻击，氧化修饰的RNA在生物体中广泛存在。 活性氧簇（R0S)能够将RNA分子中的鸟嘌呤氧化修饰成为羟基鸟嘌呤（8-0HG)。目前许多 研宄表明氧化修饰后的信使RNA分子对细胞的各种功能有重大影响，但是微小RNA氧化修 饰的研宄还十分有限。目前还没有对miRNA进行有效氧化修饰方法的报道，在体外或体内， R0S的攻击能够导致微小RNA发生鸟嘌呤特异的氧化修饰，对开发核酸药物具有重要作用。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过自由基攻击微小RNA造成 RNA氧化损伤的方法，确定在氧化应激状态下miRNA发生氧化损伤并产生8-氧鸟嘌呤。
[0004] 为了实现上述发明目的，本发明方法是在氧化应激状态下通过氧化鸟嘌呤8位碳 产生8-氧鸟嘌呤而使微小RNA发生氧化损伤，损伤方式选自以下4种的一种或几种：1)用 Fenton试剂氧化体系氧化损伤微小RNA;2)用H202处理诱导细胞凋亡的过程中氧化损伤微 小RNA;3)在铁超载诱导的心肌损伤动物模型中氧化损伤微小RNA;4)在心肌缺血-再灌注 损伤动物模型中氧化损伤微小RNA;所述Fenton试剂氧化体系是由Cu+或Fe2+与H202组成 的；Cu+/Fe2+的浓度分别为0. 5mM，H202的浓度为0.l-2mM;或者Fenton试剂氧化体系是将 Fe3+或Cu2+分别与抗坏血酸（Asc)和H202在磷酸盐缓冲液中混合制备的；所述用H202处理 诱导心肌细胞凋亡的过程中，H202的浓度优选为0. 4-lmM;用H202处理诱导心肌细胞凋亡的 时间为1-6小时；其中所述铁超载诱导的心肌损伤动物模型是通过向动物腹腔注射右旋糖 酐铁而建立的；所述右旋糖酐铁的注射剂量为12mg/日，连续注射5日；所述方法还包括纯 化被氧化损伤的微小RNA的步骤；所述纯化被氧化损伤的微小RNA是通过免疫沉淀反应进 行的，所述免疫沉淀反应中的抗体为抗8-氧鸟嗓呤抗体；纯化既是筛选氧化修饰miRNA所 需的，也是鉴定氧化修饰miRNA所需的。
[0005] 本发明通过上述方法氧化损伤的微小RNA选自rno-miR-184、rn〇-miR-21*、 rno-miR-lSSa*、rno_miR_139_3p、rno-miR-SOc-S*、rno_miR_290、rno_miR_29a、 rno-miR-SSajno-miR-SKrno-miR-SCM* 和rn〇-miR_106b中的一种或多种，其序列如序列 表中SEQIDNO:1-11所示：
[0006]rn〇-miR-184(5' -uggacggagaacugauaagggu-3' (SEQIDNO:1))
[0007]rn〇-miR-21*(5' -caacagcagucgaugggcuguc-3' （SEQIDNO:2))
[0008]rn〇-miR_135a*(5' -uguagggauggaagccaugaaa-3' (SEQIDNO:3))
[0009]rn〇-miR-139_3p(5'-uggagacgcggcccuguuggag-3'（SEQIDNO: 4))
[0010]rn〇-miR-30c_2*(5'-cugggagaaggcuguuuacucu-3'（SEQIDNO:5))
[0011]rn〇-miR-290 (5'-cucaaacuaugggggcacuuuuu-3' (SEQIDNO: 6))
[0012] rn〇-miR_29a(5' -uagcaccaucugaaaucgguua-3' （SEQIDNO:7))
[0013]rn〇-miR_23a(5' -aucacauugccagggauuucc-3' （SEQIDNO:8))
[0014]rn〇-miR-21(5' -uagcuuaucagacugauguuga-3' （SEQIDNO:9))
[0015]rn〇-miR-204*(5' -gcugggaaggcaaagggacguu-3' （SEQIDNO:10))
[0016]rn〇-miR_106b(5' -uaaagugcugacagugcagau-3' （SEQIDNO:11))
[0017] 本发明在体外的Fenton试剂氧化体系的细胞水平的H202诱导心肌细胞凋亡过程， 以及铁超载和心肌缺血-再灌注诱导心肌损伤动物模型中，miRNA发生氧化损伤，产生8-氧 鸟嘌呤；其特征如下：
[0018] l)miRNA在Cu+/Fe2+与H202构成Fenton试剂氧化体系中发生氧化损伤，S卩鸟嗓呤 8位碳被氧化产生8-氧鸟嘌呤，而单独以Fe37AsC或H202处理，不会造成miRNA氧化损伤； 证实Fenton试剂氧化体系产生的? 0H自由基是miRNA氧化损伤反应所必需的；
[0019] 2)在H202诱导心肌H9c2细胞凋亡过程中miRNA发生氧化损伤，并且在0-lmM H202处理浓度范围内，H9c2细胞的miRNA氧化损伤程度与H202处理呈剂量依赖性关系；以 0. 4nMH202处理H9c2细胞，细胞内miRNA氧化损伤程度与H202处理呈时间依赖性关系；
[0020] 3)采用铁超载和心肌缺血-再灌注诱导心肌损伤动物模型，发现与活性氧和细胞 凋亡检测结果一致，铁超载组小鼠各器官miRNA样品中8-氧鸟嘌呤含量与安慰剂组比较均 明显升高，缺血-再灌注组小鼠心脏危险区miRNA样品中8-氧鸟嘌呤含量与假手术组比较 也明显升高；
[0021] 本发明确定了 H202诱导心肌细胞凋亡过程中发生氧化损伤的miRNA亚型种类，通 过对氧化损伤miRNA在心肌细胞中生成与降解，定位特性，与其他生物大分子协同作用以 及氧化损伤miRNA调控基因表达功能差异，有助于了解在氧化应激状态下细胞凋亡及坏死 等生理病理过程的分子机制，将其作为氧化应激细胞凋亡模型。
[0022] 本发明确定了氧化损伤的miRNA中miR-184和oxi-miR-184差异调苄基因，采用 大鼠全基因组表达谱芯片分析，最终确证过表达miR-184会使33个基因在mRNA水平发生 显著变化，而过表达oxi-miR-184会使66个基因在mRNA水平发生显著变化；差异调苄基 因包括BCL2L1和BCL2L2 ;BCL2L1和BCL2L2同属细胞凋亡抑制基因Bcl-2家族，所编码蛋 白产物分别为Bcl-xL和Bcl-w，Bcl-2家族成员通常以二聚体的形式发挥作用，Bcl-xL和 Bcl-w具有对抗细胞凋亡的功能，两者说明伴随miRNA在氧化应激状态下发生氧化损伤，其 调节细胞中基因表达水平的功能也发生改变，出现差异调苄基因；其工艺过程简单，原理可 靠，损伤效果明显，应用范围广泛，应用环境友好。
【附图说明】：
[0023] 图1为HPLC-UV/MS检测miRNA样品中的8-氧鸟嘌呤，其中a为8-氧鸟嘌呤标准 品；b为双链miRNAhas-let-7a_l对照；c为铁（Fe3+)和抗坏血酸（Asc)处理组；d为H202 处理组；e为Fe3+/Asc+H202处理组；f为Cu2+/Asc+H202处理组。
[0024] 图2为H202诱导心肌H9c2细胞凋亡过程中miRNA氧化损伤，其中a为以0-200yM 的不同浓度H202处理H9c2细胞，NorthwesternBlot分析8-氧鸟嘌呤含量变化结果；b为 采用DCF荧光探针检测细胞内活性氧变化结果；c为以0. 4mM浓度的H202处理H9c2细胞 0-6h，取不同时间点检测miRNA中8-氧鸟嘌呤含量的结果；d为细胞内活性氧变化结果。
[0025] 图3为铁超载诱导心肌损伤模型中miRNA的氧化损伤，其中a为铁超载诱导心肌 损伤模型的建立；b为小鼠心脏左心室细胞活性氧水平；c为小鼠心脏左心室细胞凋亡水 平；d为Northwestern Blot分析小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑各器官miRNA中8-氧鸟嗓呤含 量的结果。
[0026] 图4为心肌缺血-再灌注损伤模型中miRNA的氧化损伤，其中a为心肌缺血-再 灌注损伤模型的建立；b为小鼠心脏边界区细胞活性氧水平；c为小鼠心脏边界区细胞凋亡 水平；d为Northwestern Blot分析小鼠心脏危险区和非危险区miRNA中8-氧鸟嗓呤含量 的结果。
[0027] 图5为芯片检测氧化miRNA，其中a为NorthwesternBlot鉴定免疫沉淀法纯化得 到的氧化miRNA的结果；b为芯片检测氧化miRNA的结果；c为利用qRT-PCR方法验证芯片 的结果。
[0028] 图6为大鼠全基因组表达谱芯片筛选得到过表达miR-184和过表达oxi-miR-184 的差异调苄基因。
【具体实施方式】：
[0029] 下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步阐述。
[0030] 实施例1 :Fent〇n试剂氧化体系造成miRNA氧化损伤，产生8-氧鸟嘌呤
[0031] 本实施例的Cu+/Fe2+与H202构成Fenton试剂氧化体系具有极强的氧化能力，是 生物体产生? 0H(羟基自由基）的主要反应；应用该反应体系体外氧化化学合成的双链 miRNA(80yg)与0. 5mM柠檬酸铁（Fe3+)或硫酸铜（Cu2+)，5mM抗坏血酸（Asc)和2mMH202，在 10禮他1^04/似2册04缓冲液&117.4)体系中，371：孵育111。孵育结束后，加入1(^11001111 甲磺酸去铁胺（铁离子清除剂）或双环己酮草酰二腙（铜离子清除剂）以终止反应。在上 述溶液中加入1/10体积的3MNaAc，1/10体积的1yg/ml糖原和2. 5倍体积的乙醇，-20°C 沉淀miRNA。上述沉淀得到的miRNA样品中加入10y1核酸酶P1 (可购自Promega, 0? 4U/ U1 储存于 300mMNaAc和 0? 2mMZnCl2,pH5. 3, -20°C冻存），37°C孵育 2h，再补加 5y1 碱 性磷酸酶（可购自？1'〇11^3，川/^1)，501：孵育60111111;200(^离心108。100^1酶解产物 转移至Micropure-EZfilter(可购自Millipore)，0°C，14000g离心 2min以去除蛋白。离 心得到的清液，如所述进行HPLC-UV/MS分析。
[0032] 本实施例的结果证实，在Cu+/Fe2+与H202构成Fenton试剂氧化体系中，miRNA发生 氧化损伤，即鸟嘌呤8位碳被氧化产生8-氧鸟嘌呤（图le和图If)，而Fe37Asc组与H202 组，因不能产生? 0H，故不造成miRNA氧化损伤（图lc和图Id)。
[0033] 实施例2 :H202诱导心肌H9c2细胞凋亡过程中miRNA氧化损伤，产生8-氧鸟嘌呤
[0034] 本实施例为检测H202诱导心肌H9c2细胞（其可得自AmericanTypeCulture Collection)凋亡过程中miRNA氧化损伤程度；分别以0-200yM的不同浓度H202处理 H9c2细胞，3h后收集细胞进行活性氧（Reactiveoxygenspecies,R0S)检测（其可得 自Invitrogen)，并采用flashPAGE?分馏器系统（Ambion，Inc)提取miRNA，如所述进行 NorthwesternBlot分析，结果见图2a和图2b。
[0035] 本