实施例的结果显示，以OmMH202处理组为对照，25yM，50yM，100yM和 200yMH202处理组的细胞内R0S水平升高倍数分别为2. 25±0. 19,3. 43±0. 31， 5. 54±0. 46,6. 72±0. 57(p〈0. 05);相应地，25yM，50yM，100yM和 200yMH202处理 组的细胞内8-氧鸟嘌呤含量升高倍数分别为1.41±0. 11，2. 01±0. 19,3. 35±0. 32， 3. 69 ±0. 29 (p〈0. 05)，证实，在0-lmMH202处理浓度范围内，H9C2细胞的miRNA氧化损伤程 度与H202浓度呈正相关；此外，以0. 4mM浓度的H202处理H9c2细胞，分别在0h，0. 5h，lh， 2h，4h和6h后的时间点收集细胞进行R0S检测和NorthwesternBlot分析（图2c和图 2d)，结果显示，以Oh处理组为对照，lh，2h，4h和6h处理组的细胞内R0S水平升高倍数分别 为 3. 29±0. 21，4. 71±0. 35,5. 35±0. 49,6. 79±0. 62,5. 99±0. 51(p〈0. 05);相应地，lh， 2h，4h和6h处理组的细胞内8-氧鸟嘌呤含量升高倍数分别为1.69±0. 55,2. 14±0. 18， 3. 01±0. 26,3. 72±0. 31，4. 06±0. 39(p〈0. 05);由此证实，以0. 4mMH202处理H9c2细胞，细 胞内miRNA氧化损伤程度与H202处理时间呈正相关。
[0036] 实施例3 :铁超载诱导心肌损伤模型中miRNA氧化损伤，产生8-氧鸟嘌呤
[0037] 本实施例的心肌细胞内铁超载（ironoverload)可引起胞内R0S水平显著升高， 并造成心肌功能受损和心肌细胞凋亡程度增高，采用定期定量给雄性C57BL/6小鼠（其可 得自中国科学院动物研宄所实验动物中心）腹腔注射右旋糖酐铁快速建立铁超载模型，剂 量为12mg/天，一周五天，注射四周后处死；心脏组织石蜡切片经普鲁士蓝铁染色后发现， 铁超载（Fe)组可见蓝色铁颗粒沉积于细胞质中，而安慰剂对照（Plecebo)组细胞未见铁 颗粒沉积，证实小鼠铁超载模型的成功建立（图3a);同时，Fe组细胞R0S和凋亡水平与 Plecebo组比较明显升高（图3b和图3c);为了进一步评定铁超载模型中miRNA氧化损伤 程度，分别提取小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑各器官miRNA进行NorthwesternBlot分析，Fe组 小鼠各器官miRNA样品中8-氧鸟嘌呤含量与Plecebo组比较均明显升高（图3d)。
[0038] 实施例4 :心肌缺血-再灌注损伤模型中miRNA氧化损伤，产生8-氧鸟嘌呤
[0039] 本实施例将各组小鼠开胸后结扎冠状动脉左前降支，分别记录结扎前ECG心电图 和结扎30min后再灌注后的心电图，动物冠状动脉结扎后逐渐出现ST段抬高，说明小鼠左 室前壁有明显缺血，灌注2h结束后，如所述采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围；危 险区（areaatrisk，AAR)为红色和白色指示区域；梗死区（infarctarea，INF)为白色指 示区域，证实心肌缺血-再灌注损伤模型的成功建立（图4a);同时，缺血-再灌注（I/R) 组细胞R0S和凋亡水平与假手术（Sham)组比较明显升高（图4b和图4c);为了进一步评 定心肌缺血再灌注模型中miRNA氧化损伤程度，分别提取小鼠心脏危险区（AAR)和非危险 区（areanotatrisk，ANAR)的miRNA进行NorthwesternBlot分析，I/R组小鼠心脏危 险区miRNA中8-氧鸟嘌呤含量与Sham组比较明显升高（图4d)。
[0040] 实施例5 :免疫沉淀法纯化氧化miRNA及芯片检测氧化miRNA
[0041] 本实施例为鉴定H202诱导细胞凋亡所导致氧化损伤的miRNA亚型种类，以0.4mM H202处理H9c2细胞，3h后收集细胞，分别提取对照组（OmMH202处理组）和H202 (0?4nMH202 处理组）细胞miRNA，采用免疫沉淀法纯化得到氧化miRNA，然后进行miRNA芯片检测，具体 方法详述如下：将2. 5 ygmiRNA与2. 5 yganti-8-oxoG抗体（可得自 QEDBioscience) 在室温下孵育lh，而阴性对照组省略抗体孵育或抗体预先与24ng/ y1 8-〇X〇G孵育lh;加 入ProteinLgelbeads(可得自Pierce，20 yl)并在4°C条件下孵育15h;孵育结束后，用 含0.04% (v/v)NP-40的PBS溶液洗涤3次；随后，按如顺序下向ProteinLgelbeads中 依次加入：300 y1含 0?04% (v/v)NP-40的 PBS溶液，30 y1的10% (w/v)SDS和300 y1的 PCI(苯酚：氯仿：异戊醇为25:24:1);将该混合液在37°C条件下孵育15min(每隔5min振 荡一次），14,OOOrpm离心5min，用以分离水相和有机相。收集的水相，并与40 y1 3M醋酸 钠（pH5. 2)，2 y1 5mg/ml糖原和lml95% (v/v)乙醇混合；将该样品冻存于-80°C，lh以 上，随后再以14,OOOrpm离心20min得到沉淀的miRNA;用75%乙醇洗涤并进行空气干燥， 将miRNA样品溶解于10ylDEPC处理水中，得到氧化miRNA;采用NorthwesternBlot鉴 定免疫沉淀法纯化得到的氧化miRNA(图5a)。
[0042] 本实施例的miRNA表达谱芯片（miRCURY?LNAArray(v. 10. 0)，购自康成生物有 限公司）的筛选；利用miRCURY?芯片标记试剂盒和RNEasyMini试剂盒（可得自Exiqon) 进行miRNA标记及浓缩标记样品，采用miRCURY?芯片微点阵试剂盒进行miRNA芯片杂 交，并在635nm处激发焚光，利用Genepix4000B进行图像扫描并使用GenepixPro6. 0 进行数据分析（图5b);通过对氧化miRNA组（oxi-miR)标准值分析，oxi-miR组共发现 有 11 个miRNA，分别为rn〇-miR-184、rn〇-miR-21*、rn〇-miR_135a*、rn〇-miR-139_3p、 rn〇-miR-30c_2*、rn〇-miR-290、rn〇-miR_29a、rn〇-miR_23a、rn〇-miR-21、rn〇-miR-204* 和 rn〇-miR-106b(表1);采用qRT-PCR方法对oxi-miR组11个miRNA进行验证，其结果与芯 片检测结果一致（图5c)。
[0043] 表1基因芯片筛选与qRT-PCR验证氧化损伤的microRNA
[0045]
[0046] 实施例6 :过表达miR-184和氧化miR-184 (oxi-miR-184)差异调苄基因表达的筛 查
[0047] 本实施例为评定miR-184和oxi-miR-184对H9c2细胞基因表达水平的影响，采用 脂质体瞬时转染H9c2细胞的方法过表达miR-184和oxi-miR-184,提取细胞总RNA，进行大 鼠全基因组表达谱分析，具体方法详述如下：
[0048] 采用实施加1所述Fe2+与H202构成Fenton试剂氧化体系，将化学合成 的miR-184mimics进行体外氧化，进而采用实施例5所述免疫沉淀方法纯化得到 oxi-miR-184。如所述[6]采用脂质体法分别瞬时转染H9c2细胞5nMmiR-184和 oxi-miR-184, 24h后收集细胞，用Trizol试剂（可得自Invitrogen)分别提取过表达对照 1组（miR-NC-1组）和过表达miR-184 (miR-184组），过表达对照2组（miR-NC-2组）和过 表达oxi-miR-184细胞总RNA，并进一步使用NucleoSpin?RNAclean-up试剂盒对总RNA 进行过柱纯化，用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。
[0049] 本实施例的大鼠全基因组表达谱芯片（27KRatGenomeArray，购自CapitalBio 公司）的筛选；米用晶芯?cRNA扩增标记试剂盒对样品RNA进彳丁焚光标记；芯片用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）进行扫描，采用LuxScan3. 0图像分析软件 (CapitalBio公司）对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，观察差异表达的基 因（图6);通过对各组标准值进行分析，发现过表达miR-184会使33个基因在mRNA水平 发生显著变化（miR-184/miR-NC彡0. 5为显著下调，miR-184/miR-NC彡2为显著上调），过 表达oxi-miR-184会使66个基因在mRNA水平发生显著变化（oxi-miR-184/miR-NC彡0. 5 为显著下调，oxi-miR-184/miR-NC彡2为显著上调），差异调苄基因包括PRKCB1，BCL2L1和 BCL2L2等，结果见表2 :
[0050] 表2基因芯片筛选过表达miR-184和oxi-miR-184的差异调苄基因
[0052]
[0053]
[0054]
【主权项】
1. 一种通过自由基攻击微小RNA造成RNA氧化损伤的方法，其特征在于该方法在氧化 应激状态下通过氧化鸟嘌呤8位碳产生8-氧鸟嘌呤而使微小RNA发生氧化损伤，损伤方式 选自以下4种的一种或几种：1)用Fenton试剂氧化体系氧化损伤微小RNA ;2)用H2O2处 理诱导细胞凋亡的过程中氧化损伤微小RNA ;3)在铁超载诱导的心肌损伤动物模型中氧化 损伤微小RNA ;4)在心肌缺血-再灌注损伤动物模型中氧化损伤微小RNA ;氧化损伤的微小 RNA 选自 rn〇-miR-184、rn〇-miR-21*、rn〇-miR_135a*、rn〇-miR-139_3p、rn〇-miR-30c-2*、 rn〇-miR-290、rn〇-miR_29a、rn〇-miR_23a、rn〇-miR-21、rn〇-miR-204* 和 rn〇-miR-106b 中 的一种或多种，其序列如序列表中SEQ IDNO :1-11所示。2. 根据权利要求1所述的一种通过自由基攻击微小RNA造成RNA氧化损伤的方法，其 特征在于所述Fenton试剂氧化体系是由Cu +或Fe 2+与H2O2组成的；Cu +/Fe2+的浓度分别为 0. 5mM，H202的浓度为0. l-2mM ;或者Fenton试剂氧化体系是将Fe 3+或Cu 2+分别与抗坏血酸 和H2O2在磷酸盐缓冲液中混合制备的；所述用H 2O2处理诱导心肌细胞凋亡的过程中，H2O2的 浓度为〇. 4-lmM ;用H2O2处理诱导心肌细胞凋亡的时间为1-6小时；其中所述铁超载诱导的 心肌损伤动物模型是通过向动物腹腔注射右旋糖酐铁而建立的；所述右旋糖酐铁的注射剂 量为12mg/日，连续注射5日；所述方法还包括纯化被氧化损伤的微小RNA的步骤；所述纯 化被氧化损伤的微小RNA是通过免疫沉淀反应进行的，免疫沉淀反应中的抗体为抗8-氧鸟 嘌呤抗体。
【专利摘要】本发明涉及一种通过自由基攻击微小RNA造成RNA氧化损伤的方法，该方法在氧化应激状态下通过氧化鸟嘌呤8位碳产生8-氧鸟嘌呤而使微小RNA发生氧化损伤，损伤方式选自以下一种或几种：1)用Fenton试剂氧化体系氧化损伤微小RNA；2)用H2O2处理诱导细胞凋亡的过程中氧化损伤微小RNA；3)在铁超载诱导的心肌损伤动物模型中氧化损伤微小RNA；4)在心肌缺血-再灌注损伤动物模型中氧化损伤微小RNA；本发明确定了H2O2诱导心肌细胞凋亡过程中发生氧化损伤的miRNA亚型种类，通过对氧化损伤miRNA在心肌细胞中生成与降解，定位特性，与其他生物大分子协同作用以及氧化损伤miRNA调控基因表达功能差异；其工艺过程简单，损伤效果明显，应用范围广泛，应用环境友好。
【IPC分类】A61K31/721, A61K33/34, A61K31/327, A61K33/26
【公开号】CN104940230
【申请号】CN201510350931
【发明人】李培峰, 高洁, 丁素玲, 周露玙
【申请人】青岛大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月24日