15W PUVA管(Waldmann, Villingen-Schwenningen，Germany ;购自 Athrodax Healthcare Internat1nal Ltd, UK)的台灯。PUVA 管的光谱范围从320-410nm，在35 Inm处具有最大量。对于UV处理的载玻片，灯被放置在离载玻片不同的距离处以产生合适的强度。在处理组中的第一个载玻片是阳性对照且强度为?1.20mW/cm2并且其余载玻片在不同的强度下。第二个为?0.8mW/cm2，第三个为?0.50mW/cm2以及第四个为?0.20mW/cm2。
[0054]对于这一新实验，细胞被暴露包埋于在载玻片上的0.5% LMP琼脂糖中。
[0055]有两个载玻片系列:
[0056]组1:
[0057]—号载玻片用100 μ I 0.5% LMP琼脂糖覆盖而无UVA处理(阴性对照)。
[0058]组2:
[0059]二号载玻片，用100 μ I 0.5% LMP琼脂糖覆盖并且UVA强度为?1.20mff/cm2 (离UVA灯的距离是15cm)(阳性对照)。
[0060]三号载玻片，用100 μ I 0.5% LMP琼脂糖覆盖并且UVA强度为?0.80mff/cm2 (离UVA灯的距离是20cm)。
[0061]四号载玻片用ΙΟΟμΙ 0.5% LMP琼脂糖覆盖并且UVA强度为?0.50mW/cm2 (离UVA灯的距离是25cm)。
[0062]五号载玻片用100 μ I 0.5% LMP琼脂糖覆盖并且UVA强度为?0.20mW/cm2。
[0063]在处理之后载玻片被侧向地浸入含有冷的裂解溶液(2.5M NaCiaOOmM EDTA,1mM Tris, 10% DMS0,1% Triton X_100，pH 10)的容器中。载玻片在4°C下孵育I小时或过夜。
[0064]裂解后，将载玻片水平地放在装有冷的电泳缓冲液(300mM NaOH, ImM EDTA,pH〈13)的电泳槽的盘上。将载玻片在4°C下在黑暗中孵育30分钟，以允许DNA的解旋以及单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)碱不稳定损伤的表达。电泳在同样的温度下在25伏以及300mA的调整的电流(通过升高或降低缓冲液水平(buffer level))下进行30分钟。
[0065]电泳后，将载玻片从槽移除并且将每一个用中性缓冲液(400mM Tris, pH 7.5)浸泡5分钟的时间，浸泡三次(Tice、Agurell等人2000 ;Anderson、Schmid等人2003)。
[0066]用20 μ g/ml溴化乙锭或适当的替代品例如SYBR Green对细胞染色并利用安装有黑白CXD摄像机的荧光显微镜检查。
[0067]针对每个重复载玻片，50个细胞被评分(共100个细胞，每个实验点进行1000次观察，允许远远足够的统计检定力以检测效果)。
[0068]使用电脑化的图像分析系统Komet 6.0 (Andor Ltd, Belfast)以测量彗星参数；然后将中位数Olive尾矩值和％尾部DNA用于统计分析。
[0069]在图1中可看到使用本方法对从包括称为癌前的那些、称为癌症的那些以及健康的对照的30名受试者获得的样品进行的实验的结果。
[0070]Olive尾矩值是DNA损伤的指示并且因此预期在所有的细胞中，伴随增加的暴露至UV诱变因素的强度(即伴随减小的UV灯的高度)，细胞的olive尾矩值会增加。利用本发明的方法，图1中的情况显然是这样。相反，利用在样品上方提供另外的屏障层并且改变灯的高度的标准正常(常规)样品彗星实验，结果与该原理并不一致(图2)。
[0071]而且，图1显示，罹患癌症或癌前状况的个体的细胞遵循相似的图谱，其与对健康个体的细胞观察到的很不同。健康对照显示出与癌症或癌前细胞很不同的图谱。这允许其样品指示对癌症倾向的受试者的明确鉴定。在图2中显示的利用标准正常(常规)彗星实验的图谱无法以这种方式使用，由于其无法从健康对照充分地区别出以提供明确且精确的结果。
[0072]值得注意的是如果利用常规彗星实验(其结果显示在图2中)，在从全血准备载玻片以及用UVA处理上有一些显著的技术困难和问题。
[0073]1.将全血与1% LMP琼脂糖混合并将其铺在载玻片上，其不易铺在载玻片上。
[0074]2.在施加时第二层100 μ I 0.5% LMP琼脂无法覆盖整个载玻片。
[0075]3.使用裂解溶液之后不可能洗除已附着至琼脂凝胶的所有红血细胞。
[0076]本发明意图缓和这些问题。
【主权项】
1.一种筛查受试者对以DNA损伤为特征的一种或更多种疾病的倾向或所述一种或更多种疾病的存在的方法，包括以下步骤: 从受试者获取全血； 将所述全血的一个或更多个样品封固在一个或更多个基底上； 将所述样品暴露至电磁辐射的不同水平或强度； 检测在每个样品中的遗传损伤水平；以及 将所述损伤水平与预先确定的值或值的模式比较。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将样品暴露至电磁辐射的不同水平的所述步骤通过改变对每个血液样品的电磁辐射的强度来进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中通过改变与辐射源之间的距离来改变所述电磁辐射的水平。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中第一样品被暴露至针对第二载玻片的?1.20mW/cm2的光强度，第二样品被暴露至?0.80mff/cm 2的光强度，第三样品被暴露至?0.50mW/cm2的光强度，以及第四样品被暴露至?0.20mW/cm 2的光强度。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述多个样品可作为单个样品取自受试者，只要其可分成用于测试的多个样品。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述样品被暴露至电磁辐射10分钟至30分钟。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述样品被暴露至电磁辐射15分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中将样品暴露至电磁辐射的不同水平的所述步骤通过改变所发射的电磁辐射的水平进行。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述样品和电磁辐射源之间不放置另外的屏障材料层。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述样品的顶部不直接放置另外的屏障材料层。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述全血包括外周全血。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在将样品暴露至电磁辐射的不同水平之前，所述方法包括将所述全血封固在基底上的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述全血被封固在含有0.5%低熔点琼脂糖?40 0C )的封固介质中。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述EM辐射为UV辐射。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其被用于筛查受试者对皮肤癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、前列腺癌或结肠-直肠癌的倾向。
16.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其被用于筛查受试者未罹患癌症、具有癌前细胞、或罹患癌症，其中所述癌症包括但不限于皮肤癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、前列腺癌、结肠-直肠癌。
17.根据权利要求1至14中的任一项所述的方法，其被用于筛查受试者对COPD、哮喘、肺气肿或结肠息肉病的倾向。
18.—种分析产品，其包括以下: 基底，全血样品可被封固至其上； 以及EM辐射源，所述EM辐射源被放置使得在其上封固全血样品的基底的表面被暴露至EM辐射，特征在于所述样品被暴露至的辐射的强度是可变的。
19.根据权利要求18所述的分析产品，其中所述样品和所述EM辐射源之间的距离是可变的。
20.根据权利要求18或19所述的分析产品，其中在所述样品的顶部不直接放置另外的屏障材料层。
21.根据权利要求18或19所述的分析产品，其中在所述多个样品的顶部不直接放置另外的屏障材料层。
22.根据权利要求18至21中的任一项所述的分析产品，其中所述全血包括外周全血。
23.根据权利要求18至22中的任一项所述的分析产品，其中所述全血被封固在含有0.5%低熔点琼脂糖(<40°C )的封固介质中。
24.根据权利要求18至23中的任一项所述的分析产品，其中所述EM辐射为UV辐射。
【专利摘要】本发明涉及确定受试者对以自由基引起的DNA损伤为特征的癌症或其他疾病状态诸如COPD或哮喘的倾向以及鉴定患有未确诊的癌症的那些受试者的方法。方法能够使用来自受试者的全血并且基于将样品暴露至电磁辐射的不同水平或强度，优选地通过改变辐射源和样品之间的距离。
【IPC分类】G01N33-49
【公开号】CN104755927
【申请号】CN201380047021
【发明人】戴安娜·安德森, 摩根·纳加弗扎德, 摩根·克莱夫·托马斯·德尼尔
【申请人】布拉德福德大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年9月10日
【公告号】EP2895853A1, US20150219619, WO2014041340A1