度为0. 2%，再加入比活为2500U/ g的胃蛋白酶〇. 4g，36°C下反应2h，得胃蛋白酶解液；
[0041] 3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 7,加入比活为30000U/g的中性蛋 白酶0. 4g，48°C下反应2h，得中性蛋白酶解液；
[0042] 4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为400000U/g的菠萝 蛋白酶0. 5g，54°C下反应3h，得菠萝蛋白酶解液；升温至88°C，保持lOmin，使酶灭活，得酶 解液；
[0043] 5)将步骤4)所得酶解液用0.4ym的滤膜抽滤，再用截留分子量为4kD的超滤膜 超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌lh后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥， 即得小分子多肽。
[0044] 实施例3
[0045] 小分子多肽按照以下步骤制备而成：
[0046] 1)将100g蚯蚓浸泡于500ml浓度2%的甲基纤维素溶液中，60min后，将蚯蚓清洗 干净后，浸泡于500ml纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切lOmin，得匀浆液；
[0047] 2)在步骤1)所得匀衆液中加入盐酸，使其终浓度为0. 4%，再加入比活为4000U/ g的胃蛋白酶〇. 5g，38°C下反应5h，得胃蛋白酶解液；
[0048] 3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 9,加入比活为60000U/g的中性蛋 白酶0. 8g，52°C下反应3h，得中性蛋白酶解液；
[0049] 4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝 蛋白酶1. 5g，56°C下反应5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至92°C，保持20min，使酶灭活，得酶 解液；
[0050] 5)将步骤4)所得酶解液用0. 5ym的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜 超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌lh后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥， 即得小分子多肽。
[0051] 对比例1
[0052] 与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤2)的胃蛋白酶水解，步骤1)后即为步 骤3)。
[0053] 对比例2
[0054] 与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤3)的中性蛋白酶水解，步骤2)后即为 步骤4。
[0055] 对比例3
[0056] 与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤4)的菠萝蛋白酶水解，步骤3)后即为 步骤5)。
[0057] 实验例1:多肽分子量的测定
[0058] 检测方法：通过凝胶层析法测定分子量，试验过程中选用0.lmol/L的Tris-HCl 洗脱液平衡处理SPhedexG-25凝胶柱后，在220nm的波长下，检测浓度为2mg/ml的标准物 质：还原性谷胱甘肽（307Da)、缩宫素（1007Da)、胰高血糖素（348?a)、和胰岛素（5808Da)， 根据标准物质分子量对数和洗脱体积，拟合得回归方程为：y= -39. 865X+203. 53(R2 = 0. 9917);其中，y为洗脱体积，x为相应分子量的对数值。
[0059] 将各实施例和对比例所得多肽分别配置为浓度为5mg/ml，在上述条件下分别进样 洗脱，将出峰体积带入标准曲线，即可得样品分子量及其分布范围，通过峰面积归一法，确 定不同分子量蛋白肽的相对百分含量，所得结果如表1所示。
[0060] 表1 :多肽分子量分布
[0061]
【主权项】
1. 一种具有清除自由基功能的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽由包括以下 步骤的方法制备而成： 1) 将蚯蚓浸泡于浓度0. 1?5%的甲基纤维素溶液中，排净沙土后，将蚯蚓清洗干净 后，浸泡于纯净水中，分散成匀浆液； 2) 在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其浓度为0.2?0.4%，再加入胃蛋白酶，36? 38°C下充分酶解后，得胃蛋白酶解液； 3) 将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 7?6. 9,加入中性蛋白酶，48?52°C 下充分酶解后，得中性蛋白酶解液； 4) 维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入菠萝蛋白酶，54?56°C下充分 酶解后，得菠萝蛋白酶解液；升温至88?92°C使酶灭活，得酶解液； 5) 将步骤4)所得酶解液用0. 4?0. 5 y m的滤膜抽滤，再用截留分子量量为4-5kD的 超滤膜超滤，所得滤液脱苦脱色，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。
2. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤1)所述将蚯蚓分散成匀浆液 的设备为高速剪切机，高速剪切机的转速为300?12000rpm，剪切时间为0. 5?20min。
3. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤2)所述胃蛋白酶的比活为 2500?4000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0. 3?0. 5%。
4. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤3)所述中性蛋白酶的比活为 30000?60000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0. 4?0. 8%。
5. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤4)所述菠萝蛋白酶的比活为 400000?800000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0. 5?1. 5%。
6. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤5)所述脱苦脱色具体为：所 得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1?3h后，过滤除去活性炭。
7. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽由包括以下步骤 的方法制备而成： 1) 将蚯蚓浸泡于质量体积比1:2?5的0. 5?2%甲基纤维素溶液中，30?60min 后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于质量体积比1:2?5的纯净水中，用高速剪切机在6000? 8000rpm条件下剪切3?lOmin，得勾衆液； 2) 在步骤1)所得匀衆液中加入盐酸，使其终浓度为0. 2?0. 4%，再加入比活为 2500?4000U/g的胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0. 3?0. 5%， 36?38°C下反应2?5h，得胃蛋白酶解液； 3) 将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 7?6. 9,加入比活为30000?60000U/ g的中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇. 4?0. 8%，48?52°C 下反应2?3h，得中性蛋白酶解液； 4) 维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为400000?800000U/g 的菠萝蛋白酶，所述菠萝蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇. 5?1. 5%，54?56°C 下反应3?5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至88?92°C，保持10?20min，使酶灭活，得酶解 液； 5) 将步骤4)所得酶解液用0. 4?0. 5 y m的滤膜抽滤，再用截留分子量为4-5kD的超 滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1?3h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷 雾干燥，即得小分子多肽。
8. 根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽由包括以下步骤 的方法制备而成： 1) 将蚯蚓浸泡于质量体积比1:2的0. 5%甲基纤维素溶液中，30min后，将蚯蚓清洗干 净后，浸泡于质量体积比1:3的纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切3min，得匀 浆液； 2) 在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0. 4%，再加入比活为3500U/g的 胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蝴质量的〇.3%，37°C下反应3h，得胃蛋白 酶解液； 3) 将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6. 8,加入比活为50000U/g的中性蛋白酶， 所述中性蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇. 5%，50°C下反应2h，得中性蛋白酶解 液； 4) 维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝蛋白 酶，所述菠萝蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的〇.8%，55°C下反应5h，得菠萝蛋白酶 解液；升温至90°C，保持15min，使酶灭活，得酶解液； 5) 将步骤4)所得酶解液用0. 45 ym的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超 滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌2h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即 得小分子多肽。
9. 权利要求1?8任意一项所述小分子多肽在制备化妆品、食品、保健品或药品中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及了一种具有清除自由基功能的小分子多肽。在与清除自由基功能相关的生物领域，蚯蚓是一种新型的高蛋白质源，蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，利用蚯蚓自溶、或外源蛋白酶降解，所获得的蚯蚓蛋白酶解产物，具有优异的清除自由基功能。本发明所述小分子多肽从蚯蚓中提取得到，将蚯蚓分散成匀浆液后，使用不同的水解酶依次进行酶解，所得酶解液经抽滤和超滤后，浓缩、干燥，即得本发明所述小分子多肽。本发明提供的多肽分子量小，致敏性弱，分子量小于1000Da的多肽占总量的90％以上；通过对DPPH清除能力的检测，本发明提供的小分子多肽具有优异的清除自由基功能。
【IPC分类】C07K1-34, C12P21-06
【公开号】CN104593457
【申请号】CN201410841942
【发明人】陈 光, 李仕林, 丁爽
【申请人】唯美度科技（北京）有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月30日