一种植物乳杆菌jla-9、及其生产的细菌素、细菌素的生产鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品微生物领域，特别涉及一种植物乳杆菌几A-9、其分泌的新型乳酸 菌细菌素及该细菌素的生产、鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 食品安全目前已经成为全世界范围内的重要课题，随着食品科技的飞速发展，越 来越多的化学添加剂应用到食品工业中，给食品安全方面带来了一些潜在危害。同时，食品 中微生物的污染也日益严重，世界上每年都有多起食品中微生物污染导致的群体性中毒事 件，在我国这种发展中国家问题尤为突出，食源性疾病的不断增加已经日益引起了公众和 政府部门的高度重视。因此，食品防腐保鲜方法的研究已经成为目前的热门研究方向。目 前，食品防腐主要采用的是化学方法和物理方法，人为的添加化学防腐剂高剂量或者长期 的摄入会对人体内产生蓄积毒性作用，对人体的肝脏等会产生有害影响，甚至一些化学防 腐剂有致畸性或致癌性等问题。物理防腐如加热灭菌会导致食品的色泽，质构及风味发生 一定的变化，从而对食品的品质造成不良的影响。而辐照灭菌等可能会破坏食品中氨基酸 结构，引起脂肪的氧化等从而导致食品的营养价值降低。因此，开发出高效、广谱、安全的天 然生物防腐剂已经成为食品工业发展的必然趋势。
[0003] 食品中能引起食品腐败的微生物种类很多，主要有细菌，霉菌和酵母。一般情况下 由于细菌的繁殖周期短，因此主要以细菌占优势。其中主要有假单胞菌属，芽孢杆菌属，肠 杆菌属，微球菌属及葡萄球菌属等。它们能有分解食品中的各种成分，产气，产色素，产酸 等，从而导致食品的腐败。对于包装食品而言，大多数细菌经过商业灭菌之后都能够被杀 死，而目前在包装品中导致食品腐败的主要芽孢杆菌类，由于其产生的芽孢具有高度的抗 逆性，在正常的巴氏杀菌条件下不能够完全杀死，当环境适宜，芽孢重新萌发，导致微生物 迅速繁殖，从而引起包装食品的腐败变质，例如枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌等能够引起面 包的粘液化，嗜热脂肪地芽孢杆菌存在果汁及水果罐头中导致产气胀罐，多粘类芽孢杆菌 在牛奶中导致牛奶变粘等。还有一些食品中的芽孢杆菌具有致病作用，如存在于豆类食品、 肉制品、焙烤食品中的蜡样芽孢杆菌能够产生肠毒素导致人呕吐腹泻，乳粉中的艰难梭菌 导致人患上结肠炎，肉类罐头，乳粉中污染的肉毒梭菌能够产生世界上最强的毒素之一肉 毒杆菌毒素，导致人体神经麻痹从而导致人体死亡。因此，抑制食品中芽孢杆菌尤为重要， 将逐渐成为一个食品保鲜研究领域的一个热点。
[0004] 乳酸菌作为一种益生菌已经应用到食品工业的各个领域，目前，许多乳酸菌已经 也用到了医疗保健方面。从数千年前人们就已经开始利用乳酸菌发酵生产米酒等食品，数 千年的应用已经证明乳酸菌是安全无害的，而且对人体有益生保健作用因此，乳酸菌已经 被国际上公认为是GRAS(generallyrecognizedassafe)菌。乳酸菌发酵能够产生细菌 素，细菌素是由乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白 质或多肽，细菌素可以抑制或者杀死生长环境中与其近缘的物种或者其他物种的微生物， 但是产生细菌素的细菌本身都具有特异性的自身免疫基因，产生的细菌素不会对细菌自身 造成伤害。虽然目前有多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都能产生细菌素，但是由于乳酸 菌被认为是安全的（GRAS)，而且大多数产生细菌素的乳酸菌都分离自天然发酵食品中，因 此乳酸菌产生的细菌素更适合在食品中应用。
[0005] 虽然国内外对不同来源的乳酸菌细菌素的研究较多，但是目前很少应用到食品工 业中，尤其是专门抑制食品中芽孢杆菌污染的细菌素研究很少，近年来，由芽孢杆菌类导致 的食品污染事件逐渐增多，因此，开发一种能够广谱高效的抑制食品中常见的腐败性及致 病性芽孢杆菌的乳酸菌新型细菌素显得尤为重要，其将具有巨大的市场应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是解决现有技术中食品污染严重，食品保鲜能力亟待加强以适应巨 大市场应用前景。
[0007] 1.本发明提供一种植物乳杆菌JLA-9,该菌种分类命名为植物乳杆菌 Lactobacillusplantarum，已于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO. 10686。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。
[0008] 2.本发明还提供一种新型细菌素，该细菌素由上述1提供的植物乳杆菌JLA-9发 酵生产的，经过纯化后应用MALDI-T0F-MS分析确定植物乳杆菌细菌素的分子量为1044Da。
[0009] 3.上述2提供的新型细菌素，具有SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0010] 4.上述2或3提供的新型细菌素的生产方法，包括下列步骤：
[0011] (1)将保藏号为CGMCC7.IM的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)JLA-9 按 体积百分比1 : 100接种于MRS培养基中，37°C进行静止培养36h后，得到含有细菌素的发 酵液；
[0012] (2)含细菌素发酵液经离心后收集上清液，萃取分离，将有机相进行真空浓缩，得 细菌素粗提物；
[0013] (3)细菌素粗提物经过S印hadexLH-20和S印hadexG-25分离收集活性馏分；
[0014] (4)细菌素活性馏分通过HPLC分离纯化细菌素。
[0015] 5.上述4提供的生产方法，其中，细菌素发酵液的具体获得步骤如下：
[0016] 将植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)JLA-9接种于试管斜面MRS琼脂培养 基上，37°C培养24h，将菌种活化；然后将活化好的菌种接种于MRS液体培养基，37°C、静止 培养16~20h，至对数生长期，制成浓度为IO7~10scfu/ml的种子液；将植物乳杆菌JLA-9 种子液以1 %浓度接种于MRS发酵培养基中，在37°C静止条件下培养36h，得到细菌素发酵 液。
[0017] 6.上述4提供的生产方法，其中，将细菌发酵素发酵液用正丁醇进行萃取分离，具 体包括如下：发酵液在9000g下离心30min除去菌体，然后用与上清液3倍体积的正丁醇以 萃取法抽提两次后，将有机相经过真空浓缩，即为获得的细菌素粗提物。
[0018] 7.上述6提供的生产方法，其中，细菌素粗提物进行分离纯化，包括如下步骤：
[0019] S印hadexLH-20纯化：将正丁醇萃取得到的细菌素粗提取，经浓缩后上样于 SephadexLH-20柱表面，打开恒流栗，调整好流速3ml/8min，采用体积比80%的色谱纯甲 醇进行洗脱，利用自动收集器收集活性馏分，得到一个活性洗脱峰。具体步骤为：让样品 完全进入凝胶柱内部后用自动收集器开始收集洗脱下来的样品，样品在凝胶柱洗脱3h，将 自动收集器设置为每9min接1管（4ml的离心管），收集每管，以蜡样芽孢杆菌为指示菌做 抑菌实验，其中第35管到第50管收集的组分具有抑菌活性，洗脱时间为495min-630min;
[0020] (3) SephadexG-25纯化：将经过SephadexLH-20纯化得到的活性馏分经过浓缩 20倍后（浓缩采用真空离心浓缩仪进行浓缩，加热温度为37°C，）上样于S印hadexG-25,采 用蒸馏水进行洗脱，流速控制3ml/8min，采用自动收集器收集活性馏分，得到一个活性洗脱 峰。具体步骤为：让样品完全进入凝胶柱内部后，用自动收集器开始收集洗脱下来的样品， 将自动收集器设置为每9min接1管（4ml的离心管），样品在凝胶柱洗脱3h，收集每管做抑 菌实验，其中第17管到第25管收集的组分具有抑菌活性，洗脱时间为333min-405min;
[0021] (4)HPLC纯化：将经过S印hadexG-25纯化得到的活性馏分经浓缩20倍后（浓缩 采用真空离心浓缩仪进行浓缩，加热温度为37°C)，采用RP-C18柱进行分离纯化；纯化条 件：洗脱液为含〇. 1 %质量的三氟乙酸的水和乙腈溶液；时间，50min，95%体积的水+5%体 积的乙腈等浓度洗脱；流速为0. 3ml/min;检测波长为259nm;细菌素HPLC洗脱保留时间为 20min；
[0022] 8.上述7提供的方法，其中，HPLC纯化步骤中高效液相色谱仪为美国 AGILENTllOOseries，配备DVD检测器。
[0023] 9.本发明还提供上述2或3所述的新型细菌素的鉴定方法，其中，将经过分离 纯化后的细菌素利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaser Desorpti