植物乳杆菌YS4在制备预防溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用的制作方法

本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种植物乳杆菌在制备食品或药品中的应用。

背景技术：

牦牛酸乳是青藏高原藏族地区的一种自然发酵乳制品，含有丰富的营养成分，具有抗氧化、降低胆固醇、调节免疫力的作用。由于特殊的自然发酵条件，包括发酵原料乳、发酵温度、发酵时间、发酵器皿，特别是特殊的发酵微生物组成，造成牦牛酸乳具有特殊风味及品质。

人类溃疡性结肠炎是一种2型辅助性t细胞(th2)介导的炎症性肠病，其病因和发病机制尚不清楚，治疗进展缓慢且缺乏特异性。噁唑酮诱导的结肠炎是一种il-4介导的th2型炎症，其组织学特征和炎症分布均类似人类溃疡性结肠炎，因此，噁唑酮诱导的小鼠结肠炎模型可作为溃疡性结肠炎发病机制研究和评估药物疗效或功能性食品生理活性作用的有益工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过噁唑酮诱导的小鼠结肠炎模型，考察从牦牛酸乳中分离得到的植物乳杆菌ys4对溃疡性结肠炎的预防效果，以便研发能够预防溃疡性结肠炎的食品或药品。

经研究，本发明提供如下技术方案：

保藏编号为cctccno：m2016750的植物乳杆菌ys4(lactobacillusplantarumys4)在制备预防溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用。

植物乳杆菌ys4(lactobacillusplantarumys4)是从青海玉树藏族自治州的牦牛酸乳中分离得到，于2016年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2016750。

本发明是在噁唑酮诱导balb/c小鼠结肠炎后，通过测定血清和结肠组织中相关指标检测植物乳杆菌ys4的结肠炎预防效果。实验结果显示，植物乳杆菌ys4能显著降低结肠炎小鼠的疾病活动指数(diseaseactivityindex，dai)，抑制结肠炎造成的结肠长度缩短，提高结肠重量/结肠长度的比值；可以显著降低结肠炎小鼠结肠组织髓过氧化物酶(mpo)、no、mda含量和提高gsh含量；还可以显著提高结肠炎小鼠血清中il-2水平和降低il-10水平。rt-pcr实验结果显示，植物乳杆菌ys4可以显著上调结肠炎小鼠结肠组织中神经型nos(nnos)、内皮型nos(enos)、c-kit、scfmrna表达，下调诱生型nos(inos)、il-8、cxcr2mrna表达。由此可见，植物乳杆菌ys4对噁唑酮诱导的小鼠结肠炎具有良好的预防效果，可用于制备预防溃疡性结肠炎的食品或药品。

本发明的有益效果在于：本发明提供了植物乳杆菌ys4在制备预防溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用，不仅扩大了植物乳杆菌ys4的应用范围，提高了其应用价值，而且给溃疡性结肠炎的治疗或保健带来了新的希望。

附图说明

图1为植物乳杆菌ys4的基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图，其中m为λdna/hindⅲmarker，1为植物乳杆菌ys4的基因组dna。

图2为植物乳杆菌ys4的16srdna基因片段的pcr扩增结果，其中m为dnamarker，c为阴性对照，1为植物乳杆菌ys4的16srdna基因片段的pcr扩增产物。

图3为植物乳杆菌ys4对噁唑酮诱导结肠炎小鼠结肠组织nnos、enos和inosmrna表达的影响。

图4为植物乳杆菌ys4对噁唑酮诱导结肠炎小鼠结肠组织c-kit和scfmrna表达的影响。

图5为植物乳杆菌ys4对噁唑酮诱导结肠炎小鼠结肠组织il-8和cxcr2mrna表达的影响。

图3至图5中，lb表示保加利亚乳杆菌，lp-ys4表示植物乳杆菌ys4。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、植物乳杆菌ys4的分离和鉴定

一、乳酸菌的分离纯化

采集青海玉树藏族自治州牧民家庭的自然发酵牦牛酸乳样品10份，每份样品用无菌玻棒充分搅匀后，吸取50ml放入无菌离心管中，置于食品采样箱内带回实验室，4℃冰箱保存。

每份牦牛酸乳样品取1ml，用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释至10^-7。取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度各1ml稀释液分别于装有15mlmrs培养基(含质量比为5％的caco3)的平皿中，混匀，置30℃恒温箱培养72±3h。每个稀释度作三个平行。菌落形成后，观察其形态特征，挑取有溶钙圈的不同菌落分别接种于脱脂乳培养基中，置30℃培养24～48h，待菌株生长良好后，划线接种于mrs琼脂培养基，置30℃培养48h；重复以上步骤至少三次，直至得到纯菌落。

将纯菌株在mrs固体培养基上划线，置30℃培养48h，用10倍放大镜观察菌落大小、形状等表观特征，进行革兰氏染色，挑取形态典型的菌株进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的球菌菌株和杆菌菌株，暂定为乳酸菌。

二、乳酸杆菌的鉴定

将初步筛选出的乳酸杆菌菌株分别进行生长温度试验(10℃、15℃、45℃、60℃,30min)、ph值梯度试验、运动性试验、接触酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、明胶液化实验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、葡萄糖产气试验、联苯胺试验、石蕊牛乳试验、精氨酸产氨试验、酪素分解试验以及各种糖醇发酵试验。

结果从10份牦牛酸乳样品中共分离纯化出20株乳酸杆菌，均为革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性。通过形态学观察和生理生化试验，将这20株菌株初步鉴定为7种乳酸杆菌，依次编号为lb1～lb7，其中，编号为lb7的乳酸杆菌初步鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)(表1)。

表1编号为lb7的乳酸杆菌的形态学特征和生理生化试验结果

注：+，阳性；－，阴性；+w，弱阳性。

三、植物乳杆菌的鉴定

取编号为lb7的乳酸杆菌液体培养的菌悬液，离心弃上清，收集菌体，按照细菌基因组dna提取试剂盒(北京索莱宝科技公司)所述方法提取基因组dna，进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶质量比浓度0.8％，电压80v，电泳80min)，用gelred核酸染料染色后，在凝胶成像系统中观察(图1)。将提取的基因组dna稀释200倍，用紫外分光光度计进行浓度纯度测定。采用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seqidno.1)和1492r：5’-ggctaccttgttacgactt-3’(seqidno.2)对16srdna基因片段进行pcr扩增(图2)。扩增产物由生工生物工程(上海)有限公司和北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，并将测序结果(seqidno.3)与genbank中相关序列进行比对。结果显示，编号为lb7的乳酸杆菌的16srdna基因片段序列与lactobacillusplantarumstraincip103151的相似性达到98％。

因此，编号为lb7的乳酸杆菌鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，将其命名为ys4，并于2016年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2016750。

实施例2、植物乳杆菌ys4对噁唑酮诱导小鼠结肠炎的预防作用

本实施例使用的主要材料、仪器与实验动物如下：植物乳杆菌ys4(保藏号：cctccno：m2016750)，保加利亚乳杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心)；噁唑酮(美国sigma公司)；mpo、no、gsh、mda、sod测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；il-2、il-10血清细胞因子测定试剂盒(美国biolegend公司)；trizol试剂、oligodt18、rnase、dntp、mlv逆转录酶(美国invitrogen公司)；roxreferencedye和sybrpremixextaqii(日本takara公司)；rt-pcr引物(北京天根生化科技有限公司)。biomate3s紫外可见光分光光度仪、a200pcr仪、lux多功能性酶标仪(美国thermofisherscientific公司)；tancon2500pcr凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)；icen-24r高速冷冻离心机(杭州奥盛仪器有限公司)。雄性7周龄spf级balb/c(体重25-30g)小鼠购自重庆医科大学动物实验中心(动物许可证号：scxk(渝)2012-0001)。

将50只balb/c小鼠随机分成5组，分别是正常组、模型对照组、保加利亚乳杆菌处理组、植物乳杆菌ys4低浓度处理组和高浓度处理组，每组10只。正常组和模型对照组正常自由摄入饮食和饮水2周；在这2周中除了正常自由摄入饮食和饮水外，保加利亚乳杆菌处理组小鼠每日每只灌胃2ml的1.0×10⁹cfu/ml的保加利亚乳杆菌，植物乳杆菌ys4低浓度处理组和高浓度处理组小鼠每日每只分别灌胃2ml的1×10⁸cfu/ml的植物乳杆菌ys4和1×10⁹cfu/ml的植物乳杆菌ys4。2周后第1天所有小鼠的腹部以2×2cm面积进行剃毛，正常组小鼠腹部涂抹0.2ml乙醇；其他各组小鼠腹部涂抹0.2ml质量比为3％的噁唑酮溶液(乙醇为溶剂)。第5天对小鼠实施禁食，但允许小鼠自由摄入饮水。禁食24h后对小鼠实施麻醉(0.1ml/10g的水合氯醛)，然后进行灌肠：用硅胶管钝头从小鼠肛门插入肠道深3.5cm，正常组小鼠注入0.15ml体积比为50％的乙醇溶液，其他各组小鼠注入0.15ml质量比为1％的噁唑酮溶液(体积比为50％的乙醇溶液为溶剂)，20s后拔出导管，同时将小鼠倒置30s。灌肠7天后断颈处死全部小鼠，收集小鼠血浆和结肠组织备用。

1、植物乳杆菌ys4对结肠炎症状的影响

灌肠后1天(第20天)、3天(第22天)、6天(第25天)分别按表2所述dai评分标准计算dai值，dai＝(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。结肠炎会导致机体体重减轻并出现腹泻和出血等症状，以体重、大便性状和便血作为计分标准的dai可以作为衡量结肠炎程度的标准。

表2dai评分标准

各组小鼠的dai值计算结果见表3，正常组小鼠在整个实验周期中的dai值保持为0.00±0.00，模型对照组小鼠在噁唑酮灌肠后dai值一直增加并一直在各组中保持最高，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4灌胃后的噁唑酮诱导结肠炎小鼠的dai值较模型对照组显著下降(p<0.05)，其中植物乳杆菌ys4高浓度处理组下降最多。

表3各组小鼠的dai值

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

取小鼠结肠组织，测定结肠的重量和长度，计算结肠重量/结肠长度的比值。结肠长度和结肠重量/结肠长度的比值同样也是衡量结肠炎程度的标准。与正常小鼠相比，结肠炎小鼠的结肠长度更短、结肠重量/结肠长度的比值更低。

各组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度的比值见表4，模型对照组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度的比值均最低，正常组小鼠最高，而植物乳杆菌ys4高浓度处理组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度的比值最接近正常组。

表4各组小鼠的结肠长度和结肠重量/结肠长度的比值

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

上述实验结果说明，植物乳杆菌ys4可以降低噁唑酮诱导的小鼠结肠炎症状，且随着浓度的增加效果更为明显，其效果优于同浓度的保加利亚乳杆菌。

2、植物乳杆菌ys4对小鼠结肠组织mpo、no、gsh和mda含量的影响

在洗净的小鼠结肠组织中加入9倍质量的生理盐水，采用超声粉碎将结肠组织匀浆，然后按试剂盒说明书对小鼠结肠组织中mpo、no、gsh和mda含量进行测定。mpo在结肠中的含量提高意味着中性粒细胞内流进入结肠组织，是发炎组织中中性粒细胞聚集降低的表现。在结肠炎过程中inos生成no加剧结肠组织的损伤，同时在结肠组织中随着no的含量增加mpo活性也随之增强，炎症加剧。结肠炎还可以导致ros(活性氧)和rns(活性氮)大量产生，使组织细胞发生毒性反应，使结肠组织发生炎症损伤。发生炎症反应后ros的大量生成将破坏机体氧化/抗氧化平衡，降低结肠组织中gsh的含量，大量的脂质过氧化反应加剧脂质过氧化终产物mda的产生。

由表5可知，模型对照组小鼠结肠组织中的mpo、no、mda含量最高，gsh含量最低；正常组小鼠的结肠组织呈现出相反的趋势，mpo、no、mda含量最低，gsh含量最高；相对于模型对照组，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以降低结肠炎小鼠结肠组织中的mpo、no、mda含量和提高gsh含量，但植物乳杆菌ys4的作用更强。

表5各组小鼠结肠组织的mpo、no、gsh和mda含量

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

3、植物乳杆菌ys4对小鼠血清细胞因子il-2和il-10水平的影响

取小鼠血清，采用elisa法按试剂盒说明书测定小鼠血清中il-2和il-10细胞因子的含量。噁唑酮诱导的结肠炎是一种th2细胞介导的炎症。炎症产生的机制是th2/th1之间的免疫网络失衡导致结肠炎。il-10是一种th2细胞产生的细胞因子，il-2是th1细胞产生的细胞因子，都与结肠炎直接相关，过低的il-2水平和过高的il-10水平都意味着结肠炎程度加深。

由表6可知，正常组小鼠血清细胞因子il-2水平显著高于其他组小鼠(p<0.05)，而il-10水平显著低于其他组小鼠(p<0.05)；和其他各组相比，植物乳杆菌ys4高浓度处理组小鼠血清细胞因子il-2和il-10水平最为接近正常组。

表6各组小鼠血清细胞因子il-2和il-10水平

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

4、植物乳杆菌ys4对小鼠结肠组织相关mrna表达的影响

取小鼠的结肠组织，粉碎后用rnazol提取结肠组织总rna，稀释至1μg/μl；取2μl稀释后的总rna提取液，依次加入1μl的oligodt18、rnase、dntp、mlv酶和10μl的5×buffer，37℃120min、99℃4min、4℃3min合成cdna；然后采用表7所述引物，rt-pcr扩增nnos、enos、inos、c-kit、scf、il-8和cxcr2的mrna表达，以持家基因gapdh作为内参照；最后用含质量比为1％的溴化乙锭的琼脂电泳检查pcr扩增产物，并用image1.44软件进行半定量分析。

表7rt-pcr引物序列

(1)植物乳杆菌ys4对小鼠结肠组织nnos、enos和inosmrna表达的影响

nos分为nnos、enos和inos，研究证实enos产生的no对控制结肠组织损伤有关键作用，inos产生的过量no则加速结肠炎症损伤，nnos下调也使inos表达加强同时大量释放no。

由图3和表8可知，正常组小鼠结肠组织的nnos、enosmrna表达最高，而inosmrna的表达最低；模型对照组小鼠的nnos、enosmrna表达最低，inosmrna的表达最高；相对于模型对照组，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以显著上调结肠炎小鼠结肠组织中nnos、enosmrna的表达和下调inosmrna的表达(p<0.05)，但植物乳杆菌ys4的作用更强。

表8小鼠结肠组织nnos、enos和inosmrna表达的半定量分析

(相对模型对照组表达倍数)

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

(2)植物乳杆菌ys4对小鼠结肠组织c-kit和scfmrna表达的影响

溃疡性结肠炎不仅表现出腹泻和便血，同时还出现结肠动力紊乱。研究证明icc(cajal间质细胞)与结肠动力有关，直接参与结肠炎进程。出现炎症性肠病时，scf对维持icc数量和功能有直接作用，scf是c-kit的天然配基，scf/kit信号途径受到损伤后icc的增殖和分化均会下降，从而加重结肠炎。

由图4和表9可知，相对于模型对照组，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以显著上调结肠炎小鼠结肠组织中c-kit和scfmrna的表达(p<0.05)，但植物乳杆菌ys4的作用更强。

表9小鼠结肠组织c-kit和scfmrna表达的半定量分析(相对模型对照组表达倍数)

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

(3)植物乳杆菌ys4对小鼠结肠组织il-8和cxcr2mrna表达的影响

il-8有炎性活性和趋化作用，cxcr是il-8受体，il-8和cxcr2均与结肠癌的发病有关，文献也报道结肠癌状态下会出现il-8和cxcr2的高表达。

由图5和表10可知，相对于模型对照组，保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌ys4都可以显著下调结肠炎小鼠结肠组织中il-8和cxcr2mrna的表达(p<0.05)，但植物乳杆菌ys4的作用更强。

表10小鼠结肠组织il-8和cxcr2mrna表达的半定量分析(相对模型对照组表达倍数)

注：字母不同表示组间差异显著(p＜0.05)。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>重庆第二师范学院

<120>植物乳杆菌ys4在制备预防溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用

<160>19

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物27f

<400>1

agagtttgatcctggctcag20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物1492r

<400>2

ggctaccttgttacgactt19

<210>3

<211>1469

<212>dna

<213>植物乳杆菌ys4（lactobacillusplantarumys4）

<220>

<223>16srdna基因片段

<400>3

catgatttacatttgagggagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccaga60

agcggggaataacacctggaaacagatgctataccgcataacaacttggaccgcatggtc120

cgagnttgaaagatggcttcggctatcagtgcaatggcggcttttggatggtcccgcggc180

gtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgaga240

gggtaatcggccacattgggactgactcacggccaaactcctacgggaggcagcagtagg300

gaatcttccacaatggacgaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaaaagggtttcg360

gctcgtaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgcagaaagccacggc420

taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgg480

gcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaa540

gaagtgcatcggaaatgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccattgtagc600

ggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcgctgtctggtctgtaac660

tgacgctgaggctcgaaagtatggtagcaaacaggattagataccctggtatccataccg720

taaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcatt780

aagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattacgggggccc840

gcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtctt900

gacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggt960

gcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttagtcccgcacgagcgcaaccc1020

ttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaacgga1080

ggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgcta1140

caatggatggtacaacagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattct1200

cagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatccggat1260

cagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgacacaccgcccgtcacaccatgagag1320

tttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaagggggacag1380

atgattagggtgggtcttgcctaatacatgcaagtcgaacgaactctggattgattggtg1440

cttgcatttcaggtattgacggtatttaa1469

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增nnosmrna表达的上游引物

<400>4

gaataccagcctgatccatggaa23

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增nnosmrna表达的下游引物

<400>5

tcctccaggagggtgtccaccgcatg26

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增enosmrna表达的上游引物

<400>6

ggagaggctgcatgacattg20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增enosmrna表达的下游引物

<400>7

ggtagagccatagtggaatgac22

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增inosmrna表达的上游引物

<400>8

agagagatcgggttcaca18

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增inosmrna表达的下游引物

<400>9

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<210>10

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增c-kitmrna表达的上游引物

<400>10

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<210>11

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增c-kitmrna表达的下游引物

<400>11

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<210>12

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增scfmrna表达的上游引物

<400>12

aaactggtggcgaatc16

<210>13

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增scfmrna表达的下游引物

<400>13

cacgggtagcaagaac16

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增il-8mrna表达的上游引物

<400>14

agaagcatggcccagaaatca21

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增il-8mrna表达的下游引物

<400>15

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<210>16

<211>18

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<213>人工序列

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<223>rt-pcr扩增cxcr2mrna表达的上游引物

<400>16

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<210>17

<211>20

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<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增cxcr2mrna表达的下游引物

<400>17

aacataacaacatctgggca20

<210>18

<211>20

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<213>人工序列

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<223>rt-pcr扩增gapdhmrna表达的上游引物

<400>18

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<210>19

<211>20

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<213>人工序列

<220>

<223>rt-pcr扩增gapdhmrna表达的下游引物

<400>19

agccttctccatggtcgtga20