植物乳杆菌在制备反刍动物甲烷减排饲料上的应用

植物乳杆菌在制备反刍动物甲烷减排饲料上的应用
【专利摘要】本发明涉及植物乳杆菌在制备反刍动物甲烷减排饲料上的应用。植物乳杆菌用在反刍动物饲料中降低瘤胃甲烷产生量是本发明的首创，在应用时添加量低，可以单独用水混匀，也可以混合在饲料中使用，添加方便。在降低甲烷排放的基础上，仍可提高营养物质消化率，优于其他甲烷抑制剂。研究表明，植物乳杆菌可在一定程度上降低反刍动物甲烷排放量，提高瘤胃发酵性能，改善瘤胃发酵类型，并提高饲料的能量利用率，具有安全、实用、有效等优势。
【专利说明】
植物乳杆菌在制备反刍动物甲烷减排饲料上的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及反刍动物养殖领域，具体涉及可降低牛羊甲烷排放量的益生菌。
【背景技术】
[0002] 反刍动物生产中，因甲烷(CH4)形式损失的能量占饲料总能的2%~15%，这不仅造成 饲料资源的浪费，而且对有害于大气环境。反刍动物瘤胃是一个动态的生态系统，其CH 4的 产生是一个复杂的过程，是瘤胃内碳水化合物发酵不可避免的产物。然而甲烷的产生会加 剧温室效应，降低饲料利用率，需要采用科学、合理的措施对其进行调控。
[0003] 目前关于瘤胃甲烷调控的研究已有很多，对甲烷生成机制的认识逐步加深。微生 态制剂作为新型的绿色添加剂，对动物及环境的副作用小，在反刍动物生产中的应用多集 中在促生长、防疾病、提高生产性能等方面，在甲烷调控方面的报道却较少。
[0004] 因此，寻找合适的微生态添加剂及其科学、合理的添加剂量以降低反刍动物甲烷 的排放量具有很重要的研究意义。
[0005] 现有的甲烷抑制剂，采用了微生物、有机化合物、植物或植物提取物等，其中：采用 有机化合物作为甲烷抑制剂的饲料，有可能因为改变饲料的适口性而影响动物的采食量和 生长;植物及植物提取物被大量报导证实对调控反刍动物甲烷排放具有积极作用，但是在 反刍动物饲料中并非常规原料或添加剂，其供给范围和供给量受到产地、产量的影响，尚不 能大规模普及。在微生物方面，CN201310161752.U公开号为CN104137944A)公开了还原性 产乙酸菌具有抑制反会动物胃内的甲烧生成机能ProteiniphilumacetatigenesSROD-l (KCCM11219P )及利用其的方法。
[0006] 益生菌定义为在微生态学理论指导下，将从动物体内分离得到的有益微生物通过 特殊工艺制成的只含活菌或者包含菌体及其代谢产物的活菌制剂，能改善动物胃肠道微生 物生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的一类微生物添加剂。益生菌在饲料中的应 用越来越广泛，成型的制剂也较多，适合大规模生产应用。目前益生菌的种类主要有:乳酸 菌、芽孢杆菌、酵母和曲霉类。其中乳酸菌是人们发现最早的有益菌之一，已广泛使用。乳酸 菌通过发酵产生的有机酸、细菌表面成分、特殊酶系等物质，能抑制腐败菌和病原菌、提高 动物免疫力、降低胆固醇、改善动物产品品质等，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理 功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等产生作 用。乳酸菌作为饲料添加剂，具有无污染、无残留、不产生耐药性等优点，并可以改善饲料风 味，促进畜禽生长，提高免疫力，增加动物对疾病的抵抗力，在目前畜牧业生产中具有良好 的发展趋势和应用前景。
[0007] 有关乳酸菌在动物生产中的积极作用的研究多集中在治疗腹泻、降低死亡率、增 强机体免疫力、提高抗病力和生产性能等方面，在反刍动物瘤胃CH 4方面的研究仍未见报 道。
[0008] 植物乳杆菌(/^(^0如(^_/_/^/5/7_/3/3?^1'腫)是乳酸菌的一种，最适生长温度为30~35 °C，厌氧或兼性厌氧，菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH 6. 5左右，属 于同型发酵乳酸菌。在饲料中应用，已发现的功能有，免疫调节，抑制致病菌，维持肠道内菌 群平衡，促进营养物质吸收等。
[0009] CN104719615A(申请号为201510036493.9)涉及一种复合乳酸菌瘤胃调控剂及其 制备方法。该复合乳酸菌瘤胃调控剂由植物乳杆菌代谢物及灭活的植物乳杆菌、乳酸乳球 菌代谢物及灭活的乳酸菌、粪肠球菌代谢物及灭活的粪肠球菌组成，该复合乳酸菌瘤胃调 控剂可促进和维护瘤胃内微生物区系平衡，稳定瘤胃pH值，提高瘤胃挥发性脂肪酸的产量， 提尚菌体蛋白的含量。
[0010] "地衣芽孢杆菌及其复合菌对后备牛生长性能和瘤胃内环境的影响" 一文中写明， 随着后备牛年龄的增加，瘤胃液中优势菌种类开始降低，最终保持稳定;添加参试益生菌还 提高了瘤胃纤维分解菌的数量(符运勤，硕士论文，地衣芽孢杆菌及其复合菌对后备牛生长 性能和瘤胃内环境的影响）。根据甲烷生成过程可以预测，纤维分解菌数量提高，会提高瘤 胃中氢的产量，从而促进甲烷的产生。同时，研究发现，动物瘤胃中纤维分解菌的数量和甲 烷菌数量呈正相关。综上，瘤胃纤维分解菌数量的提高，可能会导致甲烷产量提高，而非降 低。在"益生菌的筛选鉴定及其对断奶仔猪、犊牛生长和消化道微生物的影响"一文中提到， 从北京市大兴种猪场附近土壤中分离得到一株能抑制病原菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 生长的乳酸菌GF103,经16s rRNA基因序列分析鉴定为植物乳杆菌（ZaciokciDt/s 添加到基础日粮中饲用，可以明显增加仔猪的重量，饲料转化率较高，仔猪粪 中大肠杆菌的数量显著降低，血清IgM浓度显著整高，结果表明，日粮添加植物乳杆菌，能改 善断奶仔猪早期的生长性能（中国农业科学院，博士论文，董晓丽，益生菌的筛选鉴定及其 对断奶仔猪、犊牛生长和消化道微生物的影响）。
[0011] 经过检索，乳酸菌可用于沼气池甲烷产量增加，而在降低反刍动物甲烷瘤胃排放 量的应用方面未见报道。

【发明内容】

[0012] 本发明的目的是提供了植物乳杆菌在制备反刍动物甲烷减排饲料上的应用。
[0013] 上述应用中： 所述植物乳杆菌(Zacio/?at/s j〇_/a/3iar·)为任意植物乳杆菌。
[0014] 优选地，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌GLPOUGenBank登录号EU626013.1)。
[0015] 应用时，可将植物乳杆菌干粉用水溶解后供动物饮用，或将植物乳杆菌掺入饲料 中使用。
[0016] 所述饲料中，每千克饲料干物质中添加植物乳杆菌4X109 CFU~4X1011 CFU。 [0017] 优选地，每千克饲料干物质中添加植物乳杆菌4X109 CFU~4X101Q CFU。
[0018] 进一步优选地，每千克饲料干物质中添加植物乳杆菌4X101() CFU。
[0019] 所述饲料由以下重量份成分组成(干物质基础）：羊草50~70份，玉米17~29份，豆柏 10~19份，磷酸氢钙1.0~2.0份，石粉0.3~0.5份，食盐0.4~0.8份，预混合饲料0.1~0.3份。
[0020] 优选地，所述饲料由以下重量份成分组成（干物质基础）：羊草66.4份，玉米19.1 份，豆柏12.2份，磷酸氢钙1.25份，石粉0.35份，食盐0.5份，预混合饲料0.2份。
[0021] 所述预混合饲料可以市售购买，可为每千克饲料（除羊草外成分)提供(最低保证 值）：维生素 A 1.0~1.5万IU、维生素 D 2000~4000IU、维生素 E 50~90g、维生素0.1~ Ο · 5mg、维生素 B2 Ο · 2~Ο · 8mg、烟酸Ο · 1~Ο · 5mg、赖氨酸18~25g、蛋氨酸10~15g、色氨酸2 · 0~ 3·5g、铁50~120mg、铜10~15mg、梓90~130mg、猛100~140mg、砸0·1~0·5mg、鹏1·0~1·5mg、钻 0.2~0.8mg等微量成分。
[0022] 本发明提供的植物乳杆菌的新用途具有以下优点： 1.植物乳杆菌用在降低反刍动物饲料中的甲烷产生量是本发明的首创，在应用时添 加量低，可以单独用水混匀后饮用，也可以混合在饲料中使用，添加方便。在降低甲烷排放 的基础上，仍可提高营养物质消化率，优于其他甲烷抑制剂。
[0023] 2.发明人摈弃体外试验的缺陷，通过呼吸代谢试验方法实测甲烷排放量的方法， 筛选出有效的甲烷抑制剂及其添加比例，可不经换算直接应用于反刍动物预混合饲料中， 降低反刍动物养殖业甲烷排放水平，提高生产经济效益。采用体外培养试验得出的添加比 例，生产中需要根据采食量、瘤胃容积等因素进行换算，实际应用效果需要进一步检验。
[0024] 3.通过实测肉羊24小时的二氧化碳、甲烷排放量，在植物乳杆菌的不同添加剂量 中筛选出甲烷排放量最低的组，从而确定其在反刍动物饲料中的适宜比例。研究表明，植物 乳杆菌可在一定程度上降低反刍动物甲烷排放量，提高瘤胃发酵性能，改善瘤胃发酵类型， 并提高饲料的能量利用率，具有安全、实用、有效等优势。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 本实施例仅以植物乳杆菌GLPOUGenBank登录号:EU626013.1)(见洪梅著"青贮源 乳酸菌培养工艺及发酵效果的研究"，中国农业科学院，2011年，硕士论文)为例对发明的具 体内容做详细阐述，但是不限制本发明菌种来源的选择，植物乳杆菌GLP01活菌单位2 X 101() CFU/g，由中国农业科学院饲料研究所贮存； 预混合饲料，由北京精准动物营养研究中心生产，为每千克饲料(除羊草外饲料成分） 提供(最低保证值）：维生素 A 1.2万IU、维生素 D 3000IU、维生素 E 70g、维生素 Bi 0.3mg、维 生素 B2 0 · 5mg、烟酸0 · 3mg;赖氨酸22g、蛋氨酸12g、色氨酸2 · 8g;铁90mg、铜12mg、锌llOmg、 猛120mg、硒0.3mg、碘1.3mg、钴0.5mg等微量成分。
[0027] 其他饲料添加剂及饲料原料皆从饲料市场购买获得。
[0028] 实施例1:植物乳杆菌在反刍动物饲料中降低甲烷排放的应用 植物乳杆菌的用量为每千克饲料干物质中添加4 X 109CFU植物乳杆菌。
[0029] 饲料由以下重量百分比组成(干物质基础）：羊草70%，玉米17%，豆柏10.98%，磷酸 氢钙1.1%，石粉0.3%，食盐0.45%，预混合饲料0.17%。
[0030] 实施例2:植物乳杆菌在反刍动物饲料中降低甲烷排放的应用 植物乳杆菌的用量为每千克饲料干物质中添加4X 101() CFU。
[0031] 饲料由以下重量百分比组成(干物质基础）：羊草66.4%，玉米19.1%，豆柏12.2%，磷 酸氢钙1.25%，石粉0.35%，食盐0.5%，预混合饲料0.2%。
[0032]实施例3:植物乳杆菌在反刍动物饲料中降低甲烷排放的应用 植物乳杆菌的用量为每千克饲料干物质中添加4 X 1011 CFU。
[0033] 饲料由以下重量百分比组成(干物质基础）：羊草50%，玉米28.4%，豆柏18.2%，磷酸 氢钙1.9%，石粉0.5%，食盐0.7%，预混合饲料0.3%。
[0034] 实验例1:植物乳杆菌在反刍动物饲料中降低甲烷排放的应用效果验证 1.试验材料与设备 植物乳杆菌GLP01 (GenBank登录号EU626013.1)，活菌单位2 X 101Q CFU/g，由中国农业 科学院饲料研究所贮存，北京华农生物工程有限公司扩繁并生产。
[0035] 甲烷实测装置:开路式气体代谢系统，LGR气体分析仪，购于美国Sable公司。整套 试验装置由Sable系统的测定装置、密闭式气体代谢室和配套的计算机软件组成。一次可同 时测定6只羊的全天呼吸气体及甲烷排放量。
[0036] 2.试验动物与设计 实验动物:试验选取24只体重为(51.75 ± 1.48)kg，年龄相近、体况良好的杜泊绵羊(d) X小尾寒羊（罕）杂交F1代成年羯羊。
[0037]试验设计:试验采用单因素完全随机化试验设计，将24只羊分为4个处理组，即1个 对照组和3个试验组，每组6只羊，每只羊为1个重复，对照组饲喂基础饲粮(配方见实施例2 提供的饲料），3个试验组在基础饲粮的基础上添加植物乳杆菌，其中： 低剂量组:添加水平为每千克饲料干物质中添加4 X 109 CFU; 中剂量组:添加水平为每千克饲料干物质中添加4 X 101() CFU; 高剂量组:添加水平为每千克饲料干物质中添加4 X 1011 CFU。
[0038] 试验期31 d，其中预试期18 d，正试期13 d。
[0039] 3.试验日粮:基础饲粮由精料和羊草组成，见实施例2提供的饲料，其营养水平见 表1。
[0040] 表1基础饲粮营养水平(％，干物质基础）
4.测定指标与方法 4.1试验羊体重 进行气体代谢试验时，在试验羊进入和离开气体代谢室时分别对其进行体重测定，两 次测定的平均体重作为试验羊代谢体重的计算依据。
[0041 ] 代谢体重平均体重°·75。
[0042] 4.2 CH4 排放量 CH4排放量采用开路式气体代谢系统(Sable，USA)进行测定，系统连接6个呼吸测热箱， 可以同时测定6只羊的CH4排放量。每个呼吸测热箱内配有料槽和水槽，试验羊在试验期间 可自由采食和饮水。试验羊进入呼吸测热箱后，先适应24 h，随后测定48 h的CH4排放量。测 定系统循环一次的时间为60 min。
[0043] 开始测定时，系统首先测定试验环境中CH4的含量，测定时间为2 min，随后由环境 向呼吸测热箱内置换，置换时间为1 min，然后依次测定6个呼吸测热箱的CH4排放量，每个 呼吸测热箱测定时间为9 min，接着系统由呼吸测热箱向环境置换，置换时间为1 min，最后 再次测定试验环境中的CH4含量，测定时间为2 min。以上为Sable开路式气体代谢系统完成 一次循环的测定流程，以此循环连续测定48 h的CH4排放量。
[0044] 计算过程中，以两次试验环境中测定的CH4含量的平均值作为基底值，通过系统 Sable气体代谢系统的测定程序对应的宏文件进行计算机统计分析，得到每只试验羊每天 的CH4排放量。
[0045] 根据试验羊CH4的日排放量，计算其单位干物质采食量的的CH4排放量(L/kg DMI)、 单位代谢体重的CH4排放量(L/kg W^75)、单位干物质采食量和代谢体重的CH4排放量(L/kg WQ· 75 kg-tMI)及单位可消化干物质采食量的CH4排放量(L/kg DDMI)。
[0046] 4.3消化代谢率 试验羊粪样和尿样的采集于每天晨饲前进行。收集粪样时，将每只试验羊对应的收粪 袋取下称取重量，记录其前一天的排粪量，将每只羊的粪样混合均匀后，按排粪量的10%进 行取样。收集尿样时，收集前先向收集尿桶中加入l〇〇mL 10°/c^H2S〇4以固尿氮，收集后记录 每只试验羊对应的尿液体积，随后用4层纱布过滤，按每只羊排尿量的10%进行取样。
[0047] 将每天收集的粪样和尿样保存于-20°C冰箱。此过程连续进行6 d，并将每只羊所 有收集到的样品混合均匀后保存于_20°C冰箱备用。消化代谢试验结束后，将每只羊的粪样 置于65°C烘箱内烘干48 h，回潮48 h后称重，得出初水分含量，随后经粉碎过40目网筛制成 分析样品，以备分析检测。
[0048]按照《饲料分析及饲料质量检测技术》的方法测定饲料和粪的能量(GE)、干物质 (DM)、有机物(0M)、氮(N)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量以及尿中的能量和 氮含量，并计算相应的消化率和代谢率。
[0049] 总能摄入量(GE) =日粮干物质采食量X日粮总能含量； 甲烷能(CH4-E)=甲烷排放量(L) X 0 · 714(g/L) X 10-3 X 55 · 65MJ/kg; 消化能(DE)=总能摄入量(GE)_粪中总能排出量，其中粪中总能排出量=粪排出总量X 粪中总能含量； 代谢能(ME)=总能摄入量(GE)-粪中总能排出量-尿中总能排出量-甲烷能，粪中总能排 出量=奠排出总量X粪中总能含量，尿中总能排出量=尿排出总量X尿中总能含量； 某营养物质表观消化率(％)=(该营养物质摄入量-粪中该营养物质排出量)/该营养物 质摄入量X100%，其中该营养物质摄入量=日粮干物质采食量X日粮中该营养物质含量； 总能量消化率(DE/GE)(%)=(总能摄入量-粪中总能排出量)/总能摄入量X100%。
[0050] 总能量代谢率(ME/GE ) (%)=(摄入总能-粪中排出总能-尿中排出总能-CH4能)/摄 入总能X 100%。
[0051 ] 5.数据处理 试验数据应用Excel进行初步整理，再用统计软件SAS 9.2中的AN0VA进行单因素方差 分析，若差异显著时用Dunan氏法进行多重比较，以P〈0.05作为差异显著的判断标准。
[0052] 6.结果 6.1植物乳杆菌对甲烧排放的影响:见表2 表2植物乳杆菌对肉羊甲烷排放的影响
注：同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>〇.05)，肩标不同小写字母表 不差异显著(/^< 0.05)。下表同。
[0053] 表2结果显示：在肉羊饲粮中添加了植物乳杆菌后，与对照组相比，中剂量组显著 降低了 CH4的日排放量(L/d)(P〈0.05)、干物质采食量(DMI)基础的甲烷排放量(L/kgDMI)(P 〈0.05)、代谢体重基础的甲烷排放量(L/kgWQ·75) (P〈0.05)和干物质采食量代谢体重基础的 甲烷排放量(L/kgW0.75. kg-tMI) (K0 · 05 )。
[0054] 在相同干物质采食量下，与对照组相比，低和中剂量组显著降低了可消化干物质 基础的甲烷排放量(L/kg DDMI)(P〈0.05)，高剂量组的该项指标则差异不显著(A0.05)。
[0055] 从试验结果可以看出，植物乳杆菌对肉羊甲烷的排放具有一定程度的抑制作用， 且以中剂量组，即当植物乳杆菌的添加水平为每千克饲料干物质中4X10 1() CFU时甲烷排放 量的抑制效果最显著。
[0056] 6.2植物乳杆菌对肉羊营养物质消化代谢的影响:见表3 表3植物乳杆菌对肉羊营养物质表观消化率的影响
表3结果显示，与对照组相比，低、中和高剂量组的干物质、有机物、中性洗涤纤维和氮 等的表观消化率均显著提高。
[0057] 6.3植物乳杆菌对肉羊能量消化代谢的影响:见表4 表4植物乳杆菌对肉羊能量消化代谢的影响
表4结果显示：与对照组相比，中剂量组的甲烷能和甲烷能/食入总能的比例均显著降 低(P〈0.05)，高剂量组的相应指标显著升高(P〈0.05)，低剂量组的相应指标则差异不显著 (/^0.05)〇
[0058] 3个植物乳杆菌添加组均提高了肉羊的消化能和总能消化率(P〈0.05)，但不同添 加组之间差异(A0.05)不显著。中和高剂量组的代谢能和总能代谢率均显著高于低剂量组 和对照组(P〈〇.05)，但两组之间差异不显著(D0.05)，低剂量组的相应指标显著高于对照 组(K0.05)。
[0059] 植物乳杆菌作为肉羊的饲料添加剂，可以提高饲料的能量利用效率。
[0060] 小结： 添加植物乳杆菌可以降低肉羊的甲烷排放量，提高能量和部分营养物质的消化率。当 添加水平为每千克饲料干物质中4X109 CFU和4X101() CFU时，降低了肉羊可消化干物质 基础的CH4排放量，降幅分别为5.84%和15.28%。当添加水平为每千克饲料干物质中4 X 101() CFU时，降低了CH4的日排放量，当添加水平为每千克饲料干物质中4 X 1011 CFU时，升高了 CH4的日排放量。植物乳杆菌抑制肉羊甲烷排放的最佳添加水平为每千克饲料干物质中4X 1010 CFUo
[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 植物乳杆菌在制备反刍动物甲烷减排饲料上的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将植物乳杆菌干粉用水溶解后供动物饮 用，或将植物乳杆菌掺入饲料中使用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌（ZacioAaciDus j〇_/a/3 iar )为任意植物乳杆菌。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌（ZacioAaciBus j〇_/a/3iar?)为植物乳杆菌 GLP01(GenBank 登录号 EU626013 · 1) 〇5. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述饲料中，每千克饲料干物质中添加 植物乳杆菌4X109 CFU~4X1011 CFU。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述饲料中，每千克饲料干物质中添加植 物乳杆菌4X109 CFU ~4X101Q CFU。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述饲料中，每千克饲料干物质中添加植 物乳杆菌4X101() CFU。8. 根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述饲料由以下重量份成分组成 (干物质基础）：羊草50~70份，玉米17~29份，豆柏10~19份，磷酸氢钙1.0~2.0份，石粉0.3~ 〇. 5份，食盐0.4~0.8份，预混合饲料0.1~0.3份。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述饲料由以下重量份成分组成(干物质 基础）：羊草66.4份，玉米19.1份，豆柏12.2份，磷酸氢钙1.25份，石粉0.35份，食盐0.5份，预 混合饲料0.2份。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述预混合饲料为每千克饲料（除羊 草外成分）的营养含有以下成分：维生素 A 1.0~1.5万IU、维生素 D 2000~4000IU、维生素 E 50~90g、维生素 Βι 0· 1~0.5mg、维生素 B2 0.2~0.8mg、烟酸0· 1~0.5mg、赖氨酸18~25g、蛋氨酸 10~15g、色氨酸 2.0~3.5g、铁50~120mg、铜 10~15mg、锌90~130mg、锰 100~140mg、硒0· 1~ 0·5mg、鹏1·0~1·5mg、钻0·2~0·8mg。
【文档编号】A23K20/142GK105995061SQ201610399742
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】刁其玉, 郭江鹏, 屠焰, 肖怡
【申请人】中国农业科学院饲料研究所