一种敏捷乳杆菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种敏捷乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌是从健康猪肠道正常菌群中分离获得的一种乳酸菌，经革兰氏染色镜检、生理生化试验和16s?rRNA序列分析鉴定为一株敏捷乳杆菌。通过绘制生长曲线、抗胃肠道逆性环境试验、体外肠粘附试验筛选，此株敏捷乳杆菌和其他从肠道分离出的乳酸菌相比表现出最佳的生物学特性。将该敏捷乳杆菌充分培养后，作为饲料添加剂应用于仔猪生产，不仅能够促进生长、提高饲料利用率，还能降低腹泻率、提高动物机体免疫水平、增强抗病能力，可有效替代抗生素在饲料添加剂中的应用。本发明为动物微生态制剂提供了一种优良菌种，对提高养猪业经济效益、发展生猪健康养殖具有重要意义。CGMCC No. 1137820150914
【专利说明】
一种敏捷乳杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种敏捷乳杆菌以及该菌种的培养物在仔 猪生产中的应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素作为饲料添加剂为畜牧业的快速发展做出了巨大贡献，但其广泛长期使用 会导致残留、细菌耐药性等问题。随着人们对抗生素弊端越来越多的认识，欧盟、日本、韩国 等国家已禁止抗生素在动物饲料中使用。因此，寻找安全的、促生长、无残留、无耐药性新型 制剂作为抗生素的替代品已变得越来越重要。
[0003] 微生态制剂(Probiotics )，也叫活菌制剂(Biogen)或生菌剂，是指运用微生态学 原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经培养发酵干燥等特殊工艺 制成的对人和动物有益的生物制剂。微生态制剂作为遵循生态环境自然循环法则的绿色无 公害制剂，将是添加剂行业的一种发展趋势，是抗生素的理想替代品。但是我国对微生态制 剂的开发利用起步比较晚，用于益生菌生产的菌种缺乏，因而急需筛选出更多特性优良的 益生菌菌种以供生产应用。
[0004] 乳酸菌是微生态制剂中十分重要的一类菌，此类菌在动物肠道中定殖生长能够分 泌抗菌代谢产物(乳酸、乙酸、细菌素和H20 2等），抑制有害细菌生长繁殖，维持肠道微生态平 衡;具有促进钙磷铁吸收，合成多种维生素(如核黄素、泛酸、叶酸、维生素 B1、B2等），改善蛋 白质代谢等营养作用;可刺激肠道局部免疫反应，提高动物体液和细胞免疫水平，增强机体 抵抗力，对人和畜禽的健康生长起着有益作用。
[0005] 理想的益生乳酸菌应该来自健康动物肠道的自然菌群，本身无致病性，饲喂动物 后经过消化道的高胃酸、高胆汁作用仍保持着较高的存活率，并能在消化道上皮细胞表面 粘附定殖，发挥其益生功能。由于乳酸菌的益生作用具有宿主特异性，即分离自同一动物肠 道的菌类，一般只在本类动物肠道定殖发挥作用效果更好。因此，从猪肠道正常菌群中分离 筛选抗逆性强、性能稳定、易于生产贮存、益生作用效果好的优良猪源益生菌菌种，开发适 合大规模生产的高质量益生菌制剂，对提高养猪效率、发展健康养殖具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有微生态制剂生产菌种的不足，提供一种敏捷乳杆菌 及该乳杆菌在仔猪生产中的应用。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] -种敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P14,已于2015年9月14日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 11378。
[0009] 上述的敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P 14在仔猪生产上的应用。
[0010] 上述的敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P 14仔猪生产上应用，在猪的 基础日粮中添加敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P14，添加量为（1.8-2.2) X 10nCFU/kg，混匀后，作为日常饲料进行饲喂。
[0011 ] 上述的敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P 14作为猪饲料添加剂的应 用。
[0012] 上述的敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilis)Lact P 14作为猪饲料添加剂的应 用，将敏捷乳杆菌菌种Lact P14以无菌操作方式接入MRS肉汤(购自广东环凯生物科技有限 公司，027312)，在恒温生化培养箱中，37°C厌氧培养至菌体含量达10 1()CFU/mL，4°C保存;然 后在猪的基础日粮中添加保存的敏捷乳杆菌Lact P14,添加量为2X10nCFU/kg，混匀后，作 为日常饲料进行饲喂。
[0013] 上述敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P 14的冻干保存方法，步骤如下：
[0014] 用接种环刮取MRS培养基上生长良好的纯的敏捷乳杆菌Lact P14,勿划破琼脂;然 后加入灭菌好的冻干保护剂制成悬液，再将悬液置于安培管中于_80°C预冻l_2h，接着再真 空冷冻干燥8_24h，之后将安培管抽真空密封，放入-80°C冰箱长期保存；
[0015] 所述的冻干保护剂包括如下组分:5% (m/V)鹿糖、1 % (m/V)谷氨酸，10% (m/V)脱 脂奶粉，溶剂为纯化水。
[0016] m/V，为质量体积比，单位为g/mL。
[0017]如"5 % (m/V)蔗糖"表示，鹿糖的质量与冻干保护剂的体积比为5 %。
[0018]制成悬液时，敏捷乳杆菌Lact P14的用量与冻干保护剂的比例没有具体要求，只 要求冻干保护剂能够将刮取的MRS培养基上生长良好的纯的敏捷乳杆菌Lact P14溶解制成 悬液即可。
[0019] 本发明从健康猪肠道中分离培养乳酸菌，革兰氏染色镜检，经生理生化试验和 16s-rRNA序列分析对初步筛选得到的乳酸菌进行属种鉴定。通过对乳酸菌进行生长曲线 绘制分析、耐受力试验、体外肠道粘附试验进一步筛选，得到一株生物学特性最佳的菌种， 即敏捷乳杆菌。将该乳杆菌扩大培养，应用于仔猪生产，评价其对仔猪生产性能和抗病力的 影响。对试验得到的具有良好益生性能的敏捷乳杆菌冻干保种，为开发能有效提高养猪业 经济效益的益生菌制剂提供优良菌种。
[0020] 本发明中MRS肉汤与MRS培养基的区别是，MRS肉汤为液体状态，MRS培养基为软固 体状，在MRS肉汤中加入琼脂粉变为MRS培养基的软固体状。
[0021] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：
[0022]本发明的乳杆菌具有生长性能好、耐酸耐胆盐能力强、抵抗胃肠道逆性环境能力 强、肠道粘附效果好等优点，与现有动物微生态制剂所用的菌种相比，该乳杆菌分离自猪肠 道的正常菌群，作为益生菌应用于猪生产中能保证其进入肠道后迅速生长和定殖，利于发 挥益生功能。动物在新生期，正常菌群还处于连续变化的阶段，在这个期间使用益生菌要比 在已建立起相对稳定菌群的生长后期应用更易影响菌群，因此对仔猪使用该乳杆菌效果更 明显，具有促进生长、提高饲料利用率、提高仔猪免疫水平及抗病力等功效。本发明的乳杆 菌无耐药性、无残留、无毒副作用，可达到替代抗生素或激素类产品在饲料添加剂中应用的 目的，是一种有前途的动物微生态制剂候选菌种。
[0023]将本发明菌种的培养物添加到仔猪基础日粮中，应用于仔猪生产，通过仔猪的增 重量、饲料转化率及腹泻率观察其对动物生产性能的影响，通过检测血清中免疫球蛋白 (IgA、IgM、IgG)、细胞因子(IL-2、IL-4)水平和外周血淋巴细胞增殖能力评价其对动物免疫 功能的影响，结果说明，在仔猪日粮中添加敏捷乳杆菌能促进仔猪生长、提高饲料利用率、 减少腹泻发生，对仔猪生产性能上产生有益影响；同时，提高了血清中免疫球蛋白含量、细 胞因子水平和淋巴细胞的增殖能力，有效的增强了仔猪的免疫功能和抗病力。
[0024] 敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P14,已于2015年9月14日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 11378,保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0026]本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的 常规产品。
[0027]本发明中乙醇的浓度均为体积浓度。
[0028] 本发明实施例部分将Lact P14缩写为LP14，Lact P14和LP14都代表为本发明所要 保护的敏捷乳杆菌。
[0029] 实施例1猪肠道乳杆菌的分离培养及鉴定
[0030] (1)猪肠道乳酸菌的分离培养
[0031 ]无菌采取健康猪肠道样品，将猪肠道去除粪便，剪开肠壁，生理盐水冲洗，用钝塑 料片轻轻刮取肠黏液，再用生理盐水将肠黏液依次进行10，102，103，104，10 5，106稀释，取111^ 稀释液倾注培养于加1 % (m/v)碳酸钙的MRS培养基(MRS培养基购自广东环凯生物科技有限 公司，027315;碳酸钙为国产分析纯），各稀释度倾注2个平皿，分别在37°C的恒温培养箱中 厌氧培养48h。挑取单个有典型溶钙圈的菌落，MRS平板划线传代，纯培养。
[0032]经加1 % (m/V)碳酸钙的MRS培养基(MRS培养基购自广东环凯生物科技有限公司， 027315;碳酸|丐为国产分析纯），从样品中分离到15株菌落形态大小不一的乳酸菌，分别命 名为LP1-LP15,培养基上菌落为圆形，湿润有光泽，边缘光滑，均有溶钙圈。
[0033] (2)革兰氏染色
[0034] 分别将15株乳酸菌的纯培养物涂片固定，进行革兰氏染色:首先滴加结晶紫染色 液染色lmin;水洗后再滴加革兰氏碘液，媒染lmin;水洗后连续滴加95 %乙醇脱色20-25s， 水洗;最后，滴加石碳酸复红复染2min，水洗。用吸水纸轻轻拭去玻片上液体，待玻片风干 后，1000倍光学显微镜观察。筛选和保留被染成蓝紫色的革兰氏阳性菌。
[0035] 革兰氏染色镜检观察到15株乳酸菌均为无鞭毛，无荚膜，无芽孢的蓝紫色G+杆菌。
[0036] (3)乳酸杆菌的生理生化鉴定
[0037]根据染色镜检后15株菌的形态，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》及《伯杰氏 细菌鉴定手册》第八版和第九版，对15株乳杆菌进行属的生化试验(运动性试验、过氧化氢 酶试验、吲哚试验、明胶液化试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验及pH4.5MRS生长试验）和 种的生化试验(乳糖、麦芽糖、果糖等糖发酵试验），具体方法依照生化鉴定管等试剂标准操 作步骤进行，按要求培养后观察并分析鉴定其属种。
[0038]属的生化试验表明15株乳杆菌在pH4.5MRS肉汤中都能生长，运动性、过氧化氢酶、 吲哚、明胶液化、硫化氢、硝酸盐还原试验均为阴性，初步判断LP1-LP15均为乳杆菌属。糖发 酵试验结果见表1，基本推断LP1-LP8为一个种，即约氏乳杆菌;LP9-LP11为一个种，即罗伊 氏乳杆菌;LP12-LP15分别为嗜酸乳杆菌、鼠乳杆菌、敏捷乳杆菌和嗜淀粉乳杆菌。
[0039] 表1 LP1-LP15糖发酵试验鉴定结果
[0041] 注：（ + )为阳性反应，（_)为阴性反应，ND表示未做。
[0042] (4)乳酸杆菌的16s-rRNA鉴定
[0043] 根据GenBank上乳酸菌的16s-rRNA基因参考系列，使用Primer 5.0软件设计扩增 16s-rRNA基因的1对引物，引物由大连宝生物(TaKaRa)公司合成。引物序列如下所示：
[0045] 通过MRS肉汤37°C厌氧培养至对数生长期，按照ΒΙ0ΤΕΚΕ公司细菌DNA提取试剂盒 (DP2001)说明，提取乳酸菌的总DNA。以提取的细菌全基因组DNA为模版，用引物LP8-27F和 LP125-1541R PCR扩增各菌株16s-rRNA基因。PCR产物送至华大基因公司进行测序。从 GenBank中下载16s-rRNA参比序列，选取的参比序列为不同动物品种来源及不同种代表菌 株，利用Blast和DNAStar软件将测得的序列与参比序列进行比对分析。
[0046] 结果表明，LP1-LP8与约氏乳杆菌的同源性分别为98.1%、98.1%、97.9%、 97.5 %、98.6 %、99.6 %、98.7 %和97.5 %，LP9-LP11与罗伊氏乳杆菌的同源性分别为 98.2 %、98.7 %和98.0 %，LP12与嗜酸乳杆菌的同源性为97.4 %，LP13与鼠乳杆菌的同源性 为97.8%，LP14与敏捷乳杆菌的同源性为98.1 %，LP15与嗜淀粉乳杆菌的同源性为100%。 分子生物学鉴定结果与表型鉴定结果一致，即LP1-LP8为约氏乳杆菌、LP9-LP11为罗伊氏乳 杆菌、LP12为嗜酸乳杆菌、LP13为鼠乳杆菌、LP14为敏捷乳杆菌、LP15为嗜淀粉乳杆菌。LP14 (敏捷乳杆菌）16s-rRNA核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
[0047]实施例2菌种的生物学特性筛选 [0048] (1)乳酸菌生长曲线制定
[0049]以6 %的接种量分别将15株乳杆菌接种于MRS肉汤中，放入培养箱，37°C静置培养。 分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和2处取样，测定15株乳杆菌生长光密度值(00600 值），结果见表2，并可根据光密度值绘制生长曲线。
[0050]由表2可见，菌体密度在培养开始没有明显的改变，8h后细菌开始大量生长，进入 对数生长期，20h-24h菌体生长从对数期进入稳定期。其中，LP14的生长性能最好。
[0051 ]表2:乳酸菌生长随时间变化的光密度值测定结果
[0054] (2)培养温度对乳酸菌生长的影响
[0055] 将15株乳杆菌分别接种于MRS肉汤中，置于不同温度(37°C、45°C、65°C和80°C)水 浴培养24h后，取出观察液体培养基的变化。结果发现15株乳杆菌均不能在65°C及80°C的温 度下生长，可在37°C和45°C条件下生长。
[0056] (3)耐酸试验
[0057] 15株乳杆菌分别以6%的接种量接种到不同？田直(？册.5、？!14.5、？!13.5、？!12.5和 pHl. 5)的MRS肉汤，并在2h和4h取样，10倍梯度稀释后选择适当的稀释浓度，倾注MRS培养基 (购自广东环凯生物科技有限公司，〇27315)，37°C培养24-48h，计数活菌落数，结果见表2。 [0058]由表3可知，15株乳杆菌均能耐受pH为2.5的强酸环境。菌株在pH4.5和pH3.5时，随 培养时间的延长，活菌数呈上升趋势，该现象说明PH4.5和pH3.5对菌株的存活能力基本无 影响;菌株在PH2.5时随时间的延长，活菌数呈下降趋势，但数量级不变，该现象说明菌株能 耐受pH2.5的酸性;菌株在pHl. 5时，随时间的延长，活菌数呈数量级下降，4h后LP12和LP14 仍能保持l〇6C FU/mL，该现象说明LP12和LP14能耐pHl .5。
[0059]表3乳杆菌耐酸试验的平板平均菌落数
[0062] (4)耐胆盐试验
[0063] 15株乳杆菌分别以6%的接种量接种到含有不同胆盐浓度m/V(0%、0.1%、0.2% 和0.3% )的MRS肉汤，并在2h和4h取样，10倍梯度稀释后选择适当的稀释浓度，倾注MRS培养 基，37 °C培养24-48h，计数活菌落数，结果见表3。
[0064] 结果表明，菌株的生长受胆盐含量的抑制，同一浓度随培养时间的延长，活菌数呈 下降趋势；同一时间，随着胆盐浓度的增加，活菌数也呈下降趋势，但LP12和LP14在0.3%的 胆盐浓度下，4h后，仍能保持10 6CFU/mL，该现象说明LP12和LP14对0.3 %的胆盐有一定的耐 受能力，而LP1-LP11，LP13和LP15对0 · 3 %的胆盐耐受力极差。
[0065] 表4乳杆菌耐胆盐试验的平板平均菌落数
[0067] (5)体外肠道粘附试验
[0068] 配制PBS缓冲液（PH7.4):KC1 0.2g，NaCl 8g，KH2P04 0.24g，N a2HP04 1.44g，加 ddH20约800mL，调pH到7 · 4，加 ddH20，定容至 1000mL。
[0069] 肠粘液的制备:解剖取猪小肠，无菌生理盐水冲洗3次，剪开肠壁，钝塑料片轻轻 刮取肠黏液，无菌PBS混勾，4°C、12000r/min离心2次，每次15min。取上清液，用Bradford法 测定蛋白含量，用PBS(pH值7.4)将蛋白浓度调整为111^/1111，-20°(：保存备用。
[0070] 将上述制备的肠粘液（lmg/ml)100yl加入96孔培养板，4°C包被过夜。用ros洗涤除 去未粘附黏液，分别加 LP1-LP15乳酸杆菌悬液(108CFU/ml)各100μΙ，脱脂奶粉作阴性对照， 30°C孵育2h。用roS洗涤除去未粘附的益生菌，加50μ1 PBS及20μ1 5mg/ml ΜΤΤ(3-(4,5-二 甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝），30°C孵育lh后，加150μ1 30 %二甲 基亚砜(DMS0)振荡30min，用酶标仪测定各孔吸光度值(OD57〇)，重复3次。以roS缓冲液包被 孔作空白对照，以加脱脂奶粉悬液样品孔作阴性对照，重复3次。乳酸菌肠粘附效果用粘附 率评估，益生菌粘附率（^ΧΜ-ΑΟ/^-ΑΟΧ?ΟΟ^?ο分别是试验组、阴性对照组、 空白对照组吸光度值。
[0071] 测得的益生菌粘附率数值见表5,由表5可知15株乳杆菌对猪肠的粘附率在2.2%-4.5%之间，其中LP14对猪小肠粘附率最高。
[0072]表5乳杆菌对猪肠道粘附率
[0074] 15株乳酸菌的生物学特性研究结果说明，LP14的生长性能、耐酸耐胆盐能力及肠 道粘附效果最好。因此，选择LP14敏捷乳杆菌作为益生菌应用于仔猪生产中进一步评价其 益生性能。（LP14敏捷乳杆菌即本发明要求保护的敏捷乳杆菌）
[0075] 实施例3敏捷乳杆菌在仔猪生产上的应用
[0076] 评价敏捷乳杆菌对仔猪的益生性能，包括观察其饲喂后对仔猪生产性能和免疫功 能这两方面的影响。动物试验选择体重、窝仔数、母猪胎次、出生日期相近的长X大二元杂 交仔猪10窝（1〇±2头/窝），随机分为2个处理，即对照组(饲喂基础日粮)和试验组(饲喂基 础日粮+敏捷乳杆菌）。将敏捷乳杆菌菌种以无菌操作方式接入MRS肉汤培养基中，在恒温生 化培养箱中37 °C厌氧培养至菌体含量达101()CFU/mL，4 °C保存。试验组在基础日粮中添加敏 捷乳杆菌的量为2 X 10nCFU/kg。试验分2个阶段:第1阶段，仔猪从7日龄开始诱食教槽料，28 日龄断奶;第2个阶段，29~60日龄仔猪饲喂保育料，共计54天。分别在7、28、60日龄各称重1 次，每天准确记录仔猪的采食、腹泻等情况。饲喂结束后，无菌抗凝管采集猪前腔静脉血液， 4000r/min离心收集血清，-20°C保存，用于ELISA检测免疫球蛋白（IgA、IgM、IgG)和细胞因 子(IL-2、IL-4)，试验步骤遵照试剂盒说明书；用猪外周血淋巴细胞分离液从离心得到的血 浆中分离淋巴细胞，常规MTT法检测外周血淋巴细胞增殖能力，用刺激指数SI表示。结果见 表 6_8〇
[0077] 表6益生菌对哺乳期仔猪生产性能的影响 [0079] 表7益生菌对29~60日龄仔猪生产性能的影响
[0081]表8益生菌对仔猪免疫功能的影响
[0083] 试验结果表明：哺乳仔猪的腹泻率由10.53%降为3.57%，效果明显，平均日增重、 饲料转化率略有改善，差异不显著;益生菌对断奶仔猪生产性能的影响比较明显，平均日增 重提高81.25g，饲料转化率降低0.32,腹泻率降低了3.47%;试验组的各项免疫指标都优于 对照组。结果说明，在仔猪日粮中添加敏捷乳杆菌能促进仔猪生长、提高饲料利用率、减少 腹泻发生，对仔猪生产性能上产生有益影响；同时，提高了血清中免疫球蛋白含量、细胞因 子水平和淋巴细胞的增殖能力，有效的增强了仔猪的免疫功能和抗病力。
[0084] 实施例4敏捷乳杆菌菌种的冻干保存
[0085] 综合所有试验结果可知，从猪肠道分离出的本发明敏捷乳杆菌不仅具有较好的生 物学特性，应用到实际生产中也产生了较为理想的效果，为开发高质量的动物微生态制剂 奠定了基础。将该菌株培养后冻干，可长期保存，为今后制备益生菌制剂提供菌种。本发明 采用的冻干保存方法与其他细菌的保存方法相比，具备操作简便、细菌存活率高、保存时间 久等优点。菌种的冻干保存具体步骤如下：
[0086] 用接种环轻轻刮取MRS培养基上生长良好的纯菌种（lXloH-SXloUCFU/mLd-SmL) ， 勿划破琼脂 。加 2-3mL 灭菌好的冻干保护剂制成悬液 ，冻干保护剂配方为: 5 % (m/V) 蔗 糖、1 % (m/V)谷氨酸和10% (m/V)脱脂奶粉。取0.5ml的悬液于安培管中，菌液(即悬液)勿滴 在安培管管壁上，-80°C冰箱预冻l_2h，最后将冷冻的样品安培管置于冷冻干燥机的干燥箱 内，真空冷冻干燥8-24h，取出安培管，抽真空密封，放入-80 °C冰箱长期保存。
[0087]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【主权项】
1. 一种敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P14,已于2015年9月14日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 11378。2. 权利要求1所述的敏捷乳杆菌(LactobaciIlus agiIis)Lact P14在仔猪生产上的应 用。3. 根据权利要求2所述的敏捷乳杆菌(LactobaciIlus agiIis)Lact P14仔猪生产上应 用，其特征在于，在猪的基础日粮中添加敏捷乳杆菌(LactobaciIlus agiIis)Lact P14,添 加量为(1.8-2.2) X IO11CFlVkg，混匀后，作为日常饲料进行饲喂。4. 权利要求1所述的敏捷乳杆菌(LactobaciIlus agiIis)Lact P14作为猪饲料添加剂 的应用。5. 根据权利要求4所述的敏捷乳杆菌(LactobaciIlus agiIis)Lact P14作为猪饲料添 加剂的应用，其特征在于，将敏捷乳杆菌菌种Lact P14以无菌操作方式接入MRS肉汤，在恒 温生化培养箱中，37 °C厌氧培养至菌体含量达101()CFU/mL，4 °C保存;然后在猪的基础日粮中 添加保存的敏捷乳杆菌Lact P14,添加量为2 X IO11CFlVkg，混匀后，作为日常饲料进行饲 喂。6. 权利要求1所述的敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)Lact P14的冻干保存方法， 其特征在于，步骤如下： 用接种环刮取MRS培养基上生长良好的纯的敏捷乳杆菌Lact P14,勿划破琼脂;然后加 入灭菌好的冻干保护剂制成悬液，再将悬液置于安培管中于-80°C预冻l_2h，接着再真空冷 冻干燥8_24h，之后将安培管抽真空密封，放入-80°C冰箱长期保存； 所述的冻干保护剂包括如下组分:5%(m/V)蔗糖、l%(m/V)谷氨酸，10%(m/V)脱脂奶 粉，溶剂为纯化水。
【文档编号】C12N1/04GK105950496SQ201610079357
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年2月4日
【发明人】邓绍贤, 张以芳, 杨洁, 邓绍纲, 郑锦玲, 张云娟, 张娜娜, 柴俊
【申请人】曲靖市千村农牧科技有限公司