一种用于鉴定中药党参的引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药党参的引物对及其应用。

背景技术：

党参为桔梗科植物党参、素花党参或川党参的干燥根，是我国常用的药食两用中药。具有健脾益肺，养血生津的功效。现代药理研究表明党参具有抗肿瘤作用，增强免疫力，延缓衰老的作用，对胃粘膜损伤具有保护作用，能改善记忆障碍，调节血糖的作用等。近年来，由于党参在治疗冠心病、高血脂症、低血压和功能性子宫出血等病症方面取得了新的进展，并将党参用于保健食品的研制与开发，其用量迅速增长。我国是党参的主要产区和分布中心，全世界有党参属植物40余种，我国有39种之多，党参同属近源植物地上部分外观相近，尽管利用传统鉴别方法可将各个种加以区分，但鉴定需要很丰富的经验，同时也存在一定的主观性。

由于受经济利益的驱使和物种鉴别水平的限制，目前党参药材的地方习用品较多，如同属的轮叶党参、脉花党参、管花党参、新疆党参等，还有桔梗科金钱豹属金钱豹(土党参)、伞形科防风属防风等与党参药材性状相似的伪品入药，严重影响了党参药材的质量和临床用药安全，因此党参药材的基原鉴定十分重要，迫切需要快速准确鉴定党参药材的有效方法。

技术实现要素：

本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种稳定、准确的鉴别党参及其混伪品，以达到保障党参临床疗效的目的，本发明提供了一种用于鉴定党参的引物对及其应用。

技术方案：一种用于鉴定中药党参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

优选的，所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。

表1引物对及发卡结构序列

所述引物对在制备鉴定中药党参试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。

优选的，所述试剂盒鉴定中药党参的步骤包括：

(1)提取党参样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的，所述党参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。

优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

有益效果：(1)本发明所述引物对准确性高、通用性好，可数字化，可重复利用；(2)本发明所述引物对的应用中样品处理简单，实用性好。

附图说明

图1是实施例1～3pcr鉴定结果电泳图；

其中m为分子量为2000的maker；b1为实施例1pcr产物鉴定结果；b2为实施例2pcr产物鉴定结果；b3为实施例3pcr产物鉴定结果。

具体实施方式

实施例1

一种用于鉴定中药党参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。

所述引物对在制备鉴定中药党参试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。

所述试剂盒鉴定中药党参的步骤包括：

(1)提取党参样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述党参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。

所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

实施例2

一种用于鉴定中药党参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。

所述引物对在制备鉴定中药党参试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。

所述试剂盒鉴定中药党参的步骤包括：

(1)提取党参样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述党参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。

所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

实施例3

一种用于鉴定中药党参的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。

所述引物对在制备鉴定中药党参试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。

所述试剂盒鉴定中药党参的步骤包括：

(1)提取党参样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释550倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释55倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述党参样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。

所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。

sequencelisting

<110>苏州市李良济健康产业有限公司

<120>一种用于鉴定中药党参的引物对及其应用

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