核酸扩增反应方法、核酸扩增反应装置以及核酸扩增反应用试剂与流程

本发明涉及核酸扩增反应方法、核酸扩增反应装置以及核酸扩增反应用试剂。
背景技术：
：近年来，随着基因的利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用了基因的医疗备受注目，除此之外在农业、畜牧业领域中，在品种辨别、品种改良中使用了基因的方法也被较多地开发。作为用于利用基因的技术，pcr(polymerasechainreaction：聚合酶链反应)法等技术广泛普及。今天，pcr法在生物体物质的信息解析中成为必不可缺的技术。pcr法是对包含成为扩增的对象的核酸(靶核酸)以及试剂的溶液(反应液)实施热循环，从而使靶核酸扩增的方法。热循环是使两个阶段以上的温度周期性地施加于反应液的处理。在pcr法中，通常实施两个阶段或者三个阶段的热循环的方法。例如，在专利文献1中记载了一种核酸扩增反应装置，其使填充有反应液(液滴)以及不与反应液混和且比重小于反应液的液体(油等)的反应容器绕旋转轴旋转，凭借比重差使反应液移动并进行热循环。在专利文献1中，为了检测核酸扩增，而使用荧光标志探针。专利文献1：日本特开2012-115208号公报然而，要求基于pcr的产物的生成时间的缩短化。然而，在专利文献1所记载的技术中，若使pcr的反应时间(改性反应用的时间、退火反应/伸长反应用的时间)缩短(若使pcr高速化)，则例如存在核酸与荧光标志探针不充分地混合(hybridization)，从而无法高灵敏度地检测核酸的扩增的情况。技术实现要素：本发明的几个方式的目的之一在于提供一种即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增的核酸扩增反应方法。另外，本发明的几个方式的目的之一在于提供一种即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增的核酸扩增反应装置。另外，本发明的几个方式的目的之一在于提供一种即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增的核酸扩增反应用试剂。本发明的核酸扩增反应方法包含对包含核酸的扩增所使用的核酸扩增反应试剂的反应液施加用于使上述核酸扩增的热循环的工序，在上述热循环中，退火反应以及伸长反应用的加热时间为1秒以上10秒以下，上述核酸扩增反应试剂包含正向引物、反向引物、聚合酶以及荧光标志探针，包含于上述反应液的上述正向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反应液的上述反向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反应液的上述聚合酶的量为0.5u以上4u以下，包含于上述反应液的上述荧光标志探针的浓度为0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸扩增反应方法中，即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增(详细参照后述的“4.实验例”)。在本发明的核酸扩增反应方法中，上述核酸扩增反应试剂也可以包含dntp，包含于上述反应液的上述dntp的浓度为0.125mm以上1mm以下。在上述的核酸扩增反应方法中，即使使pcr高速化，也能够更加可靠且高灵敏度地检测核酸的扩增。在本发明的核酸扩增反应方法中，也可以是：上述正向引物的浓度为0.8μm以上3.2μm以下，上述反向引物的浓度为0.8μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量为1u以上4u以下，上述荧光标志探针的浓度为0.3μm以上1.2μm以下，上述dntp的浓度为0.25mm以上1mm以下。在上述的核酸扩增反应方法中，即使使pcr高速化，也能够更加高灵敏度地检测核酸的扩增。在本发明的核酸扩增反应方法中，也可以是：上述正向引物的浓度为1.6μm以上3.2μm以下，上述反向引物的浓度为1.6μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量为2u以上4u以下，上述荧光标志探针的浓度为0.6μm以上1.2μm以下，上述dntp的浓度为0.5mm以上1mm以下。在上述的核酸扩增反应方法中，即使使pcr高速化，也能够进一步高灵敏度地检测核酸的扩增。在本发明的核酸扩增反应方法中，也可以是：上述正向引物的浓度为2.4μm以上3.2μm以下，上述反向引物的浓度为2.4μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量为3u以上4u以下，上述荧光标志探针的浓度为0.9μm以上1.2μm以下，上述dntp的浓度为0.75mm以上1mm以下。在上述的核酸扩增反应方法中，即使使pcr高速化，也能够进一步高灵敏度地检测核酸的扩增。本发明的核酸扩增反应装置包括：安装部，其收容包含核酸的扩增所使用的核酸扩增反应试剂的反应液以及比重与上述反应液比重不同且不与上述反应液混和的液体，并能够安装具有供上述反应液移动的流路的核酸扩增反应用盒；温度梯度形成部，其在上述流路形成温度梯度；以及移动机构，其以对上述反应液施加用于使上述核酸扩增的热循环的方式使上述反应液移动，上述移动机构在上述热循环中，以退火反应以及伸长反应用的加热时间成为1秒以上10秒以下的方式使上述反应液移动，上述核酸扩增反应试剂包含正向引物、反向引物、聚合酶以及荧光标志探针，包含于上述反应液的上述正向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反应液的上述反向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反应液的上述聚合酶的量为0.5u以上4u以下，包含于上述反应液的上述荧光标志探针的浓度为0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸扩增反应装置中，即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增。本发明的核酸扩增反应用试剂为包含于施加用于使核酸扩增的热循环的反应液的核酸扩增反应用试剂，在上述热循环中，退火反应以及伸长反应用的加热时间为1秒以上10秒以下，上述核酸扩增反应用试剂包含正向引物、反向引物、聚合酶以及荧光标志探针，包含于上述反应液的上述正向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反应液的上述反向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反应液的上述聚合酶的量为0.5u以上4u以下，包含于上述反应液的上述荧光标志探针的浓度为0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸扩增反应用试剂中，即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增。附图说明图1是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应用盒的剖视图。图2是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应用盒的剖视图。图3是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应用盒的剖视图。图4是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应用盒的剖视图。图5是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置的立体图。图6是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置的立体图。图7是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置的分解立体图。图8是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置的剖视图。图9是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置的剖视图。图10是本实施方式的核酸扩增反应装置的功能框图。图11是用于对本实施方式的核酸扩增反应方法进行说明的流程图。图12是使核酸扩增反应用试剂的浓度变化的情况下的pcr结果。图13是使核酸扩增反应用试剂的浓度变化的情况下的pcr结果。图14是标准条件以及高速条件下的pcr结果。图15是多重pcr结果。具体实施方式以下，使用附图对本发明的优选的实施方式详细地进行说明。此外，以下说明的实施方式适当地限定权利要求书记载的本发明的内容。另外，以下说明的构成的全部不限定于是本发明的必要构成要件。1.核酸扩增反应用试剂首先，对本实施方式的核酸扩增反应用试剂进行说明。核酸扩增反应用试剂收容于核酸扩增反应用盒。图1是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应用盒10的剖视图。如图1所示，核酸扩增反应用盒10包含容器12与帽14。如图1所示，容器12例如具有圆筒状的侧壁部12a与半球状的底部12b。容器12具有流路16。流路16由容器12形成。流路16沿着圆筒状的侧壁部12a的中心轴(未图示)延伸。帽14堵塞与容器12的底部12b对置的端部的开口。帽14相对于容器12能够装卸。容器12以及帽14的材质例如为玻璃、高分子、金属等。在容器12的底部12b例如固定被冻结干燥的核酸扩增反应用试剂24。若如图2所示卸下帽14并使用移液管2等向上述的核酸扩增反应用盒10导入模板核酸溶液22，则如图3所示被导入的模板核酸溶液22下降至底部12b，而与核酸扩增反应用试剂24接触。核酸扩增反应用试剂24凭借模板核酸溶液22的水分而解除冻结干燥从而被获取至模板核酸溶液22，进而如图4所示成为反应液20。因此，反应液20包含模板核酸以及核酸扩增反应用试剂24，从而进行核酸的扩增反应。反应液20收容于核酸扩增反应用盒10，并存在于流路16。反应液20在液体30中以液滴的状态被保持。在图示的例中，反应液20的形状呈球状。反应液20例如比重大于液体30。反应液20伴随着核酸扩增反应用盒10的移动，而在流路16中相对于容器12相对地移动。模板核酸溶液22是包含模板核酸的溶液。在将模板核酸溶液22导入容器12内时，帽14被从容器12取下，在导入模板核酸溶液22后，再次被安装于容器12。模板核酸溶液22例如通过如下方式获得。即，利用棉棒等采集工具，采集人、细菌等的源自生物的细胞或者病毒等检体，使用已知的提取方法，从检体提取模板核酸。然后，使用已知的精制方法，以成为规定浓度的方式精制模板核酸溶液。此外，模板核酸溶液22的溶剂例如是水(蒸留水、灭菌水)、tris-edta(ethylenediaminetetraaceticacid：乙二胺四乙酸)溶液(te)。核酸扩增反应用试剂24收容于核酸扩增反应用盒10，例如在容器12的底部12b被冻结干燥(冷冻干燥)。核酸扩增反应用试剂24是使用于核酸的(靶核酸的)扩增反应的试剂。核酸扩增反应用试剂24包含引物、聚合酶、荧光标志探针以及dntp。引物设计为对模板核酸进行退火。核酸扩增反应用试剂24在双链构造的模板核酸(双链dna)改性后，包含对一方的单链构造的模板核酸(单链dna)进行退火的正向引物(forwardprimer)与对另一方的单链dna进行退火的反向引物(reverseprimer)。包含于反应液20的正向引物的浓度为0.4μm以上3.2μm以下，优选为0.8μm以上3.2μm以下，更加优选为1.6μm以上3.2μm以下，进一步更加优选为2.4μm以上3.2μm以下。包含于反应液20的反向引物的浓度例如为0.4μm以上3.2μm以下，优选为0.8μm以上3.2μm以下，更加优选为1.6μm以上3.2μm以下，进一步更加优选为2.4μm以上3.2μm以下。若为上述的范围，则即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增(详细参照“4.实验例”)。包含于反应液20的正向引物的浓度与反向引物的浓度例如相同。作为聚合酶，虽不被特别地限定，但能够列举dna(deoxyribonucleicacid：脱氧核糖核酸)聚合酶。dna聚合酶在对单链构造的模板核酸(单链dna)进行退火的引物的末端聚合与模板核酸的碱基互补的核甙酸。作为dna聚合酶，优选耐热性的酶、pcr用酶，例如，虽存在taq聚合酶、tfi聚合酶、tth聚合酶或者它们的改良型等非常多数的出售品，但优选进行热启动(hotstart)的dna聚合酶。包含于反应液20的聚合酶的量为0.5u以上4u以下，优选为1u以上4u以下，更加优选为2u以上4u以下，进一步更加优选为3u以上4u以下。若为上述的范围，则即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增。荧光标志探针用于使核酸的扩增量定量。荧光标志探针例如是包含指针色素以及淬灭色素的水解探针。作为水解探针的荧光标志探针在与单链dna混合(退火)而形成双链构造的期间，指针色素因接近该指针色素的淬灭色素(因淬灭效应)，而抑制发光。但是，若通过聚合酶分解荧光标志探针，则淬灭效应消除，从而指针色素发光。通过该发光，能够使核酸的扩增量定量。包含于反应液20的荧光标志探针的浓度为0.15μm以上1.2μm以下，优选为0.3μm以上1.2μm以下，更加优选为0.6μm以上1.2μm以下，进一步更加优选为0.9μm以上1.2μm以下。若为上述的范围，则即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增(详细参照“4.实验例”)。dntp表示4种脱氧核苷三磷酸(deoxynucleotidetriphosphate)的混合物。即，dntp表示datp(deoxyadenosinetriphosphate：脱氧腺苷三磷酸)、dctp(deoxycytidinetriphosphate：脱氧胞苷三磷酸)、dgtp(deoxyguanosinetriphosphate：脱氧鸟苷三磷酸)以及dttp(thymidinetriphosphate：胸苷三磷酸)的混合物。dna聚合酶在退火的引物的末端接合datp、dctp、dgtp、dttp，而形成新的dna。包含于反应液20的dntp的浓度为0.125mm以上1mm以下，优选为0.25mm以上1mm以下，更加优选为0.5mm以上1mm以下，进一步更加优选为0.75mm以上1mm以下。若为上述的范围，则即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增(详细参照“4.实验例”)。此外，反应液20也可以进一步包含水、缓冲液(例如，mgcl2、tris-hcl以及kcl混合的液体)。液体30收容于核酸扩增反应用盒10，并配置于流路16。在图示的例中，流路16被反应液20以及液体30填充(充满)。液体30是不与反应液20混和，即不混杂的液体。液体30进一步也不与模板核酸溶液22以及核酸扩增反应用试剂24混和。液体30的比重与反应液20的比重不同。具体而言，液体30的比重小于反应液20的比重。因此，反应液20凭借重力的作用，向重力发挥作用的方向移动。液体30例如是二甲基硅油、石蜡油等。此外，如上，对将被冻结干燥的核酸扩增反应用试剂24固定于容器12的底部12b，将模板核酸溶液22导入容器12内，使模板核酸溶液22与核酸扩增反应用试剂24接触从而形成反应液20的例子进行了说明。然而，也可以在容器12外调制包含模板核酸与核酸扩增反应用试剂24的溶液，将该溶液导入被液体30填充的容器12内，从而反应液20存在于容器12内。2.核酸扩增反应装置接下来，参照附图对本实施方式的核酸扩增反应装置进行说明。图5以及图6是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置100的立体图，图5表示打开盖体60的状态，图6表示关闭盖体60的状态。图7是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置100的主体部50的分解立体图。图8以及图9是示意性地表示本实施方式的核酸扩增反应装置100的、沿图6的a-a线剖视图。图10是本实施方式的核酸扩增反应装置100的功能框图。此外，为了方便，在图5中，简化图示核酸扩增反应用盒10。另外，在图5以及图6中，省略荧光测定器80的图示。另外，在图8以及图9中，箭头g的方向为重力发挥作用的方向(重力作用方向)。在图8中，加热部52、53的配置表示作为第一配置的状态，在图9中，加热部52、53的配置表示作为第二配置的状态。另外，为了方便，在图10中，省略主体部50以及盖体60的图示。如图5～图10所示，核酸扩增反应装置100包含主体部50、盖体60、移动机构70、荧光测定器80、处理部90、操作部92、显示部94以及存储部96。核酸扩增反应装置100例如为升降式pcr装置。如图7所示，主体部50具有安装部51、第一加热部52、第二加热部53、隔离件54、底板55、凸缘56以及固定板57。安装部51具有能够安装核酸扩增反应用盒10的构造。具体而言，如图5所示，安装部51具有供核酸扩增反应用盒10插入(insert)并安装的构造。在图7所示的例中，安装部51是贯通第一加热部52的第一加热部件52b、隔离件54以及第二加热部53的第二加热部件53b的贯通孔。安装部51的个数也可以为多个，在图示的例中为20个。第一加热部52在将核酸扩增反应用盒10安装于安装部51的情况下，如图8以及图9所示，将流路16的第一区域16a加热至第一温度。在图示的例中，第一加热部52位于比第二加热部53更靠盖体60侧。第一加热部52例如具有产生热的机构与将产生的热传递至核酸扩增反应用盒10的部件。在图7所示的例中，第一加热部52具有第一加热器52a与第一加热部件52b。第一加热器52a例如为盒加热器，被导线58连接于未图示的外部电源。第一加热器52a插入设置于第一加热部件52b的孔，第一加热器52a发热，从而第一加热部件52b被加热。第一加热部件52b是将从第一加热器52a产生的热传递至核酸扩增反应用盒10的部件。第一加热部件52b例如是铝制的块部件。流路16的第一区域16a是被第一加热部件52b包围的区域。第二加热部53在将核酸扩增反应用盒10安装于安装部51的情况下，将流路16的第二区域16b加热至与第一温度不同的第二温度。第二加热部53具有第二加热器53a与第二加热部件53b。第二加热部53除了加热的核酸扩增反应用盒10的区域以及加热的温度与第一加热部52不同以外，具有与第一加热部52相同的构造以及功能。流路16的第二区域16b是被第二加热部件53b包围的区域。第一加热部52以及第二加热部53的温度被未图示的温度传感器(例如热电偶)以及处理部90控制。例如，将第一加热部52控制为第一温度，将第二加热部53控制为第二温度，从而能够将核酸扩增反应用盒10的第一区域16a加热至第一温度，将第二区域16b加热至第二温度。隔离件54设置于第一加热部52与第二加热部53之间。隔离件54具有将第一加热部52与第二加热部53之间隔热的功能。底板55是保持核酸扩增反应用盒10的部件。底板55决定核酸扩增反应用盒10的高度方向的位置。即，将核酸扩增反应用盒10插入至与底板55接触的位置，从而相对于加热部52、53将核酸扩增反应用盒10保持于规定的位置。在底板55设置有用于供来自荧光测定器80的激励光以及供反应液20的荧光通过的贯通孔55a。凸缘56以及固定板57是用于固定加热部52、53以及隔离件54的部件。在图示的例中，将两张固定板57嵌合于凸缘56，加热部52、53、隔离件54以及底板55固定于固定板57。盖体60覆盖安装部51。在图5所示的例中，在固定板57设置有磁铁部62，盖体60能够被磁铁部62固定于主体部50。此外，隔离件54、底板55、凸缘56、固定板57以及盖体60的材质例如为隔热材料。移动机构70是基于来自处理部90的输入信号使主体部50旋转的机构。由此，移动机构70能够将加热部52、53向第一配置(参照图8)与第二配置(参照图9)切换。其结果，移动机构70能够以对反应液20施加用于使核酸扩增的热循环的方式使反应液20移动。在第一配置中，第一加热部52与第二加热部53相比在重力作用方向位于下方。在第二配置中，第二加热部53与第一加热部52相比在重力作用方向位于下方。移动机构70例如具有未图示的马达以及驱动轴。驱动轴与主体部50的凸缘56连接。驱动轴相对于核酸扩增反应用盒10的长度方向垂直设置，若使马达动作，则以驱动轴为旋转的轴使主体部50旋转。荧光测定器80是测定收容于核酸扩增反应用盒10的反应液20的荧光强度(荧光亮度)的测定器。如图9所示，荧光测定器80在第二配置中，相对于核酸扩增反应用盒10的底部12b隔开规定距离对置地配置。荧光测定器80基于来自处理部90的输入信号，将与包含于反应液20的荧光标志探针的荧光色素对应的激励光向反应液20照射，来测定由反应液20发光的荧光强度。此外，荧光测定器80可以测定与一个荧光色素对应的荧光强度，也可以测定与多个荧光色素对应的荧光强度。如图10所示，处理部90根据例如存储于存储部96的程序，进行用于控制移动机构70、荧光测定器80的处理。处理部90例如通过cpu(centralprocessingunit中央处理机)等的处理程序等实现。操作部92取得与用户的操作对应的操作信号，进行将操作信号发送至处理部90的处理。操作部92例如通过按钮、键、触摸面板型显示器、话筒等实现。显示部94显示由处理部90生成的图像。显示部94例如通过lcd(liquidcrystaldisplay液晶显示器)、crt(cathoderaytube阴极射线管)等实现。存储部96存储处理部90用于进行各种计算处理、控制处理的程序、数据等。另外，存储部96被使用为处理部90的作业区域，用于暂时存储处理部90根据各种程序执行的计算结果等。存储部96例如通过ram(randomaccessmemory随机存取存储器)等实现。3.核酸扩增反应方法接下来，参照附图对本实施方式的核酸扩增反应方法进行说明。图11是用于对本实施方式的核酸扩增反应方法进行说明的流程图。以下，作为一个例子，对使用了核酸扩增反应装置100的核酸扩增反应方法进行说明。首先，将核酸扩增反应用盒10安装于核酸扩增反应装置100的安装部51(步骤s2)。具体而言，在向填充有液体30的容器12导入反应液20后，将核酸扩增反应用盒10安装于安装部51。例如，在向安装部51安装核酸扩增反应用盒10后，利用盖体60覆盖安装部51。此处，如图8所示，加热部52、53的配置为第一配置。在第一配置中，在重力作用方向的流路16的最下部存在第一区域16a。因此，比重大于液体30的反应液20位于第一区域16a。接下来，处理部90若从操作部92接受开始热循环处理的主旨的信号，则控制加热部52、53，对核酸扩增反应用盒10的第一区域16a以及第二区域16b进行加热，而在流路16形成温度梯度(步骤s4)。具体而言，第一加热部52将第一区域16a加热至第一温度，第二加热部53将第二区域16b加热至低于第一温度的第二温度。由此，在流路16的第一区域16a与第二区域16b之间形成有温度在第一温度与第二温度之间逐渐变化的温度梯度。此处，加热部52、53是形成温度从第一区域16a朝向第二区域16b降低的温度梯度的温度梯度形成部。第一温度是适于双链dna的解离(改性反应)的温度，例如，为95℃以上110℃以下。第二温度是适于退火反应以及伸长反应的温度，例如，为50℃以上75℃以下。加热部52、53的配置为第一配置，因此若对核酸扩增反应用盒10进行加热，则反应液20被加热至第一温度。接下来，处理部90若第一加热部52到达第一温度经过第一时间(第一期间)，则控制移动机构70，而将加热部52、53的配置从第一配置向第二配置切换(步骤s6)。处理部90也可以内置计时器。第一时间是改性反应用的加热时间，例如，为1秒以上10秒以下。移动机构70被处理部90控制，以第一时间成为1秒以上10秒以下的方式使反应液20移动。具体而言，处理部90对移动机构70进行控制而使主体部50旋转180°。由此，加热部52、53的配置从第一配置被切换成第二配置。如图9所示，第二配置是使第二区域16b在重力作用方向位于流路16的最下部的配置。在第二配置中，第一区域16a与第二区域16b的重力作用方向的位置关系与第一配置相反。因此，反应液20通过重力的作用从第一区域16a向第二区域16b移动。处理部90在将加热部52、53的配置设为第二配置后，使移动机构70的动作停止第二时间(第二期间)。由此，加热部52、53的配置被保持于第二配置。第二时间是退火反应以及伸长反应用的加热时间，为1秒以上10秒以下。移动机构70被处理部90控制，以第二时间成为1秒以上10秒以下的方式使反应液20移动。接下来，处理部90判定从第一配置向第二配置切换的次数(循环数)是否到达预先存储于存储部96的规定的次数(步骤s8)。每当进行从第一配置向第二配置的切换，处理部90均使循环数存储于存储部96，而将该循环数与预先存储于存储部96的规定的次数进行比较。处理部90在步骤s8中判定为循环数到达规定的次数的情况下(在图11中，为“是”的情况下)，结束处理。另一方面，处理部90在步骤s8中判定为循环数未到达规定的次数的情况下(在图11中为“否”的情况下)，移至步骤s10。在步骤s10中，处理部90控制移动机构70，将加热部52、53的配置从第二配置向第一配置切换。处理部90在将加热部52、53的配置设为第一配置后，使移动机构70的动作停止第一时间。然后，处理部90再次移至步骤s6，而将加热部52、53的配置从第一配置向第二配置切换。如以上所述，处理部90更换第一配置与第二配置的位置并且使加热部52、53(使主体部50)旋转直至循环数成为规定的次数，从而使反应液20在流路16中往复运动。由此，核酸扩增反应装置100能够对反应液20施加用于使核酸扩增的热循环。处理部90进一步与上述的热循环处理同时期地进行扩增解析处理。由此，在核酸扩增反应装置100中，能够实时进行pcr。具体而言，每当将加热部52、53的配置保持于第二配置，处理部90均相对于荧光测定器80输入用于给予测定指示的信号。然后，处理部90作为荧光测定器80的测定结果，从荧光测定器80取得荧光强度，并将该荧光强度存储于存储部96。另外，处理部90也可以基于从操作部92被输入的信号，从存储部96读出作为应该反复的循环数被设定的次数对应的荧光强度，基于该荧光强度，生成表示荧光强度相对于循环数的推移的扩增曲线。处理部90也可以基于该扩增曲线对相对于核酸的扩增效率的优劣进行判定，并使判定结果、扩增曲线显示于显示部94。此外，如上所述，在步骤s8中，处理部90虽对循环数是否到达规定的次数进行判定，但处理部90也可以对取得的荧光强度是否到达预先存储于存储部96的规定值进行判定。然后，处理部90也可以在判定为取得的荧光强度到达规定值的情况下，结束处理，在判定为取得的荧光强度未到达规定值的情况下，移至步骤s10。另外，如上，虽将第二温度设为退火反应以及伸长反应用的温度，但也可以将第二温度设为退火反应以及伸长反应中的任意一方的反应用的温度，也可以将第二时间设为退火反应以及伸长反应中的任意一方的反应用的加热时间。在该情况下，虽未图示，但核酸扩增反应装置100具有将流路16的第三区域(与第一区域以及第二区域不同的区域)加热至第三温度(与第一温度以及第二温度不同的温度)的第三加热部。第三温度是退火反应以及伸长反应中的另一方的反应用的温度，第三时间是退火反应以及伸长反应中的另一方的反应用的加热时间。但是，为了实现pcr的高速化，优选将第二温度设为退火反应以及伸长反应用的温度。4.实验例以下，表示实验例，对本发明更加具体地进行说明。此外，本发明不限定于以下的实验例。4.1.样品的调制作为模板核酸，使用a型的流感(infa)病毒的质体dna100复印品(1反应管)。此外，100复印品是lamp法(荣研化学)的lod(limitofdetection检测极限)。将上述模板核酸添加于核酸扩增反应用试剂而调制了下述的混合试剂溶液。具体而言，调制了“1倍”、“2倍”、“4倍”、“6倍”、“8倍”、“10倍”、“12倍”7种混合试剂溶液。例如“2倍”的混合试剂溶液使聚合酶、dntp、引物、荧光标志探针的每一个相对于“1倍”的混合试剂溶液包含2倍。此外，下述的各试剂的液量(体积)是相对于混合试剂10μl的值。即，例如在“1倍”的混合试剂溶液中，聚合酶在混合试剂容器10μl中包含0.1μl。＜“1倍”的混合试剂溶液的组成＞＜“2倍”的混合试剂溶液的组成＞＜“4倍”的混合试剂溶液的组成＞＜“6倍”的混合试剂溶液的组成＞＜“8倍”的混合试剂溶液的组成＞＜“10倍”的混合试剂溶液的组成＞＜“12倍”的混合试剂溶液的组成＞此外，在上述的混合试剂溶液中，聚合酶使用了lifetechnologies社制。dntp使用了roche社制。正向引物以及反向引物使用了sigmaaldrich社制。荧光标志探针使用了sigmaaldrich社制的taqman(注册商标)探针。水使用了roche社制。缓冲液的组成如下所述。mgcl2：25mmtris-hcl(ph9.0)：250mmkcl：125mm正向引物、反向引物、荧光标志探针的序列如下述表1所述。此外，在表1中，“fam”是指针色素，“bhq1”是淬灭色素。表1infa检测用正向引物5’gaccratcctgtcacctctgac3’infa检测用反向引物5’agggcattytggacaaakcgtcta3’infa检测用荧光标志探针5’fam-cacaaatcctaaaattccct-bhq13’4.2.pcr结果从上述混合试剂溶液的每一个作为反应液提取1.6μl，注入填充有硅油的核酸扩增反应用盒。此外，从“1倍”的混合试剂溶液获得的包含于反应液的聚合酶的量相当于0.5u。即，从“2倍”、“4倍”、“6倍”、“8倍”、“10倍”、“12倍”的混合试剂溶液获得的包含于反应液的聚合酶的量分别相当于1u、2u、3u、4u、5u、6u。将第一温度(改性反应用的温度)设为105℃，将第一时间(改性反应用的期间)设为4秒，将第二温度(退火反应以及伸长反应用的温度)设为60℃，将第二时间(退火反应以及伸长反应用的期间)设为6秒，相对于各反应液，使用核酸扩增反应装置100那样的升降式pcr装置进行pcr。此外，pcr以105℃加热10秒进行热开始。图12是表示从“1倍”～“6倍”的混合试剂溶液获得的反应液的pcr结果的图表。图13是表示从“8倍”～“12倍”的混合试剂溶液获得的反应液的pcr结果的图表。如图12以及图13所示，pcr相对于各反应液各进行了两次。在图12以及图13中，横轴表示热循环的循环数，纵轴表示由荧光测定装置测定出的荧光强度。如图12以及图13所示，在“1倍”～“8倍”的范围内，能够确认荧光强度的增加。荧光强度在“2倍”～“8倍”的范围内进一步增加，在“4倍”～“8倍”的范围内更进一步增加，在“6倍”～“8倍”的范围内更加进一步增加。因此，将包含于反应液的正向引物以及反向引物的浓度设为0.4μm以上3.2μm以下，将包含于反应液的聚合酶的量设为0.5u以上4u以下，将包含于反应液的荧光标志探针的浓度设为0.15μm以上1.2μm以下，将包含于反应液的dntp的浓度设为0.125mm以上1mm以下，从而明确即使使pcr高速化，也能够高灵敏度地检测核酸的扩增。另外，将正向引物以及反向引物的浓度设为0.8μm以上3.2μm以下，将聚合酶的量设为1u以上4u以下，将荧光标志探针的浓度设为0.3μm以上1.2μm以下，将dntp的浓度设为0.25mm以上1mm以下，从而明确即使使pcr高速化，也能够更加高灵敏度地检测核酸的扩增。另外，将正向引物以及反向引物的浓度设为1.6μm以上3.2μm以下，将聚合酶的量设为2u以上4u以下，将荧光标志探针的浓度设为0.6μm以上1.2μm以下，将dntp的浓度设为0.5mm以上1mm以下，从而明确即使使pcr高速化，也能够更进一步高灵敏度地检测核酸的扩增。另外，将正向引物以及反向引物的浓度设为2.4μm以上3.2μm以下，将聚合酶的量设为3u以上4u以下，将荧光标志探针的浓度设为0.9μm以上1.2μm以下，将dntp的浓度设为0.75mm以上1mm以下，从而明确即使使pcr高速化，也能够更加进一步高灵敏度地检测核酸的扩增。此外，在上述的实验例的pcr中，将第二时间设为6秒，但若将引物、荧光标志探针以及dntp的浓度和聚合酶的量设为上述范围内，则第二时间只要为1秒至10秒，则能够高灵敏度地检测核酸的扩增。若将第二时间设为不足1秒，则核酸扩增反应装置、核酸扩增反应用盒的设计变得困难。即，将第二时间设为1秒以上，从而核酸扩增反应装置、核酸扩增反应用盒的设计变得容易，从而能够提高设计的自由度。图14是表示将第一时间设为5秒，将第二时间设为20秒的条件(标准条件)下的pcr结果与将第一时间设为3秒，将第二时间设为6秒的条件(高速条件)下的pcr结果的图表。如图14所示，在高速条件下，荧光强度降低。这被考虑为在高速条件下，核酸与荧光标志探针无法充分地混合是重要因素。上述的荧光强度的降低被确认为是在将第二时间设为10秒以下后。若将引物、荧光标志探针以及dntp的浓度和聚合酶的量设为上述范围，则即使使pcr高速化，核酸与荧光标志探针也充分地混合，从而能够高灵敏度地检测核酸的扩增。图15是表示将第一时间设为4秒，将第二时间设为6秒时的多重(multiplex)pcr(多项目同时pcr)结果的图表。在图15中，将b型的流感(infb)病毒100复印品设为模板核酸时，作为核酸扩增反应用试剂，使用仅能够检测infb的试剂、能够检测infb以及infa的试剂、能够检测infb、infa以及噬菌体ms2的试剂进行了pcr。如图15所示，pcr相对于各反应液各进行两次。如图15所示，在多重pcr中，荧光强度降低。将引物、荧光标志探针以及dntp的浓度和聚合酶的量设为上述范围内，从而能够使荧光强度增加，因此在pcr的高速化、进行多重pcr的情况下，能够称为特别地有效。本发明包含与在实施方式中说明的构成实际相同的构成(例如，功能、方法以及结果相同的构成，或者目的以及效果相同的构成)。另外，本发明包含置换在实施方式中说明的构成的非本质的部分的构成。另外，本发明包含能够起到与在实施方式中说明的构成相同的作用效果的构成或者实现相同的目的的构成。另外，本发明包含对在实施方式中说明的构成附加了公知技术的构成。符号说明2…移液管；10…核酸扩增反应用盒；12…容器；12a…侧壁部；12b…底部；14…帽；16…流路；16a…第一区域；16b…第二区域；20…反应液；22…模板核酸溶液；24…核酸扩增反应用试剂；30…液体；50…主体部；51…安装部；52…第一加热部；52a…第一加热器；52b…第一加热部件；53…第二加热部；53a…第二加热器；53b…第二加热部件；54…隔离件；55…底板；55a…贯通孔；56…凸缘；57…固定板；58…导线；60…盖体；62…磁铁部；70…移动机构；80…荧光测定器；90…处理部；92…操作部；94…显示部；96…存储部；100…核酸扩增反应装置。【序列表自由文本】序列编号1是infa的正向引物的序列。序列编号2是infa的反向引物的序列。序列编号3是infa的荧光标志探针的序列。【序列表】请参照附页序列表<110>精工爱普生株式会社<120>核酸扩增反应方法、核酸扩增反应装置以及核酸扩增反应用试剂<130>j018697301<160>3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>infa正向引物<400>1gaccratcctgtcacctctgac22<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>infa反向引物<400>2agggcattytggacaaakcgtcta24<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>infa荧光探针<400>3cacaaatcctaaaattccct20当前第1页12