核酸的扩增和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用
【专利摘要】本发明涉及扩增和/或检测方法，其用于防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成；c)在这些处理之后，在所述生物学样品中加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增和/或被检测的条件下。本发明还涉及应用所述方法的试剂盒，以及涉及所述方法或者所述试剂盒在特异性扩增和检测细菌、真细菌、真菌、泛真菌(pan-fungal)、病毒或者酵母靶中的应用。本发明优选用在诊断领域中。
【专利说明】核酸的扩増和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用
[0001] 本发明是申请日为2010年1月4日，申请号为201080004048.X，标题为"核酸的扩增 和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用"的专利申请的分案申请。
[0002] 本发明设及一种扩增方法，其用于防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物 学样品中的污染物，在运种方法中，处理所述生物学样品W使得所述感兴趣的核酸的一种 碱基转变为另一种碱基，W及导入特异于转变的核酸的引物和检测探针。本发明还设及应 用所述方法的试剂盒，W及所述方法或者试剂盒在特异性扩增和检测细菌、真细菌、真菌、 泛真菌(pan-fungal )、病毒或者酵母祀中的应用。
[0003] 分子生物学的进步已经使其可W操作核酸。目前体外基因扩增方法在生物学诊断 中成为必不可少的工具，例如使得已知DNA或者RNA序列可W被大量拷贝，在相对短的时间 内W十亿的数量级倍增。运些技术的主要缺点是不希望的核酸被扩增，导致错误的结果，即 甚至在不存在所寻找的祀的情况下出现阳性结果。运些被称作由于污染所致的假阳性。
[0004] 通过PCR(聚合酶链反应）、NASBA(基于核酸序列的扩增）、TMA(转录介导的扩增)或 者扩增遗传学材料的任何其它技术扩增细菌祀是一种灵敏性技术，其要求使用没有所有痕 量污染核酸的水溶液、酶、试剂等W及塑料容器。事实上，由于运些技术的灵敏性，运些污染 核酸可W被扩增，并且可W产生假阳性，显著降低了诊断检验的可靠性。在细菌或者真菌扩 增情况中运是真实存在的，甚至在泛细菌(也称作真细菌（eubacterial))和泛真菌扩增中 更明显，其中使用的引物(和探针)能扩增(及检测)大多数细菌或者真菌祀。此外，在运种特 殊的情况中，用于生产扩增试剂盒的大多数试剂衍生自天然来源(核巧酸、酶等），因此外源 核酸污染的潜在危险较高。因此，在用于评估生物学样品中细菌污染水平并通过扩增进行 的检测中，由于使用的一些酶衍生自细菌克隆并提供可能被扩增的核酸，因此会系统地产 生阳性结果，导致错误的诊断。
[0005] 运种污染也可W来自环境及来自去污不良的设备，例如：实验工作台、实验人员、 设备W及移液装置，甚至是塑料容器。
[0006] 已经实施了针对限制运些污染的一些建议。运些建议包括例如设及样品处理(特 别是灭菌技术)或者实验设备(物理上分隔的工作带，使用排风罩，在外部和内部之间的压 力梯度，W便流体总是使得W希望的方向排出等)的预防方法。
[0007] 正如已经提及的，不可忽略的污染源存在于实际用于扩增反应的原材料中，如酶、 试剂、塑料容器中。因此，Corless C.E.等描述了化q聚合酶的污染对于检测RNA 16S的实时 PCR灵敏性的不利影响（J.Clin.Microbiol. ; (2000) ;May;38(5): 1747-52)。
[000引纠正扩增所需的酶污染第一种方式是酶促去污染方法。
[0009]由Aslikenas S.et al.(Biotechniques;2005;Jul. ;39(1) :69-73)描述的酶促方 法包括对含有扩增必需的所有元素的溶液进行去污染。运种方法包括在RT-PCR范围内使用 限制酶混合物。运些酶使含有待扩增的祀RNA的扩增反应混合物中存在的双链DNA降解。然 后在发生逆转录时，通过加热使其失活。因此也描述了运种方法在存在祀双链DNA的情况中 的另一种PCR应用，但是限于使用单一类型的限制酶(Type IIS RE)。然而，使用限制酶具有 仅使双链脱氧核糖核酸片段化的缺点，所述双链脱氧核糖核酸必须具有所用酶的特定限制 位点。因此，没有除去单链形式的和/或具有极少运种限制位点的污染成分。
[0010] 去污染的其它酶促方法包括在与核酸祀位接触之前从溶液中防止不希望的核酸。 专利申请W0-A-99/07887描述了在与核酸祀位接触之前使用不耐热的DNase降解反应混合 物中包含的双链脱氧核糖核酸。然后通过加热使所述酶失活。运种技术的主要缺点是在反 应混合物中通过加热使运种酶失活需要使用耐热聚合酶。此外，反应混合物中存在的试剂 也可W由于溫度而改变。
[0011] 现有技术还提示处理试剂或者原材料的非酶促方法。
[0012] 因此，Mohammadi T.et al.(J.Clin.Microbiol. ;2003;0ct. ;41(10):4796-8)描 述了一种技术，其包括试剂的柱过滤，用于在扩增之前提取及任选通过限制酶Sau3AI消化 PC时式剂。过滤技术的缺点是运些技术不能用于复合的培养基而不改变其浓度或者性质。此 夕h运种技术不能除去塑料容器上存在的污染物。
[0013] 专利申请W0-A-94/12515描述了使用光反应性化合物处理含有化q聚合酶及潜在 污染核酸的溶液的方法。运种光反应性化合物，如巧喃香豆素(furocoumarin)衍生物，通过 暴露于紫外线而活化。除了其限制性应用之外，运种技术的主要缺点是由于所述核酸的随 机降解而不是非常有效，W及其可W产生仍可被扩增的片段。运种技术的另一缺点是其仅 对使用的化q聚合酶的酶制备物去污染。核酸扩增方法需要的其它试剂如水、缓冲液、塑料 容器等必须通过其它方法去污染。运样需要耗时且可能昂贵的其它操作。
[0014] 由Delehanty J.B.et al.，（RNA. ;2005;May; 11(5) :831-6)描述的另一非酶促方 法应用钻复合物W抑制翻译。运种复合物使得DM和RNA的憐酸二醋键水解。
[0015] 运种技术的主要缺点是核酸的不完全降解W及缓慢的去污染反应(24小时）。
[0016] 本
【申请人】的专利申请W0-A-2008/132412描述了通过金属馨合剂使核巧酸序列失 活的方法。在扩增步骤之后，片段化复合物，如双（1，10-菲咯嘟)/化，用于对溶液存在的所 有核酸去污染。运样使得可W避免新样品被得自先前扩增反应的扩增子污染。
[0017] 在第一种应用的情况中，运个方法的主要问题是其未真正使所有污染核酸降解， 而仅降解得自先前扩增反应的扩增子。另一方法必须在运个方法上游及并行使用，W除去 核酸扩增反应需要的原材料污染。
[0018] 因此仍然需要简便且有效的技术针对感兴趣的核酸处理生物学溶液或者液体生 物学样品，W便极大地降低或者甚至消除进行核酸扩增需要的所有试剂W及设备上存在的 污染物的影响。运也使得不必使用常规技术对试剂和环境去污染，运些技术非常复杂且通 常无效，且存在再污染的危险。
[0019] 本发明人因此提议用于处理含有感兴趣的核酸的溶液的一种完全新的方法，其不 是对扩增反应的扩增试剂包括原材料直接去污染，而是使扩增绝对特异于初始生物学样品 中存在的感兴趣的祀核酸。
[0020] 为此，
【申请人】因此提议使用化学或者酶试剂修饰生物学样品的祀核酸的序列，W 转变感兴趣的核酸。运种操作可W就在扩增之前但是在加入扩增需要的试剂进行所述扩增 之前进行。然后利用适于特异性杂交于转变的祀的引物和检测探针进行扩增和检测步骤， 所述引物和检测探针不特异性杂交于衍生自例如试剂或者水或者塑料容器等的任何污染 成分。运种方法使得在提取祀直至对其扩增期间不必对使用的所有试剂和设备进行去污 染。
[0021] 根据第一个实施方案，本发明设及一种扩增方法，其用于防止含有感兴趣的希望 扩增的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：
[0022] a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，W使得所述感兴趣的核酸的一种类 型的碱基转变为另一种类型的碱基；
[0023] b)加入扩增引物，用W特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由Ξ种不 同类型的碱基组成；
[0024] C)在运些处理之后，向所述生物学样品加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、 核巧酸、酶，W及预先合成的所述引物；
[0025] d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增的条件下。
[00%]根据第二个实施方案，本发明还设及一种检测方法，其用于防止含有希望扩增和 检测的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：
[0027] a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，W使得所述感兴趣的核酸的至少一 种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；
[0028] b)加入扩增引物和检测探针，分别用W扩增和用W检测从感兴趣的核酸的扩增获 得的扩增子，每种引物和探针由Ξ种不同类型碱基组成；
[0029] C)向所述生物学样品加入扩增和检测所需的试剂，如水溶液、溶剂、核巧酸、酶，W 及预先合成的所述引物和探针；
[0030] d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增W及产生的扩增子被检测的条 件下。
[0031] 无论使用哪种先前的方法，根据本发明的一个优选的实施方案，在步骤a)和b)之 间进行至少一个纯化步骤。
[0032] 无论使用哪种先前的方法，也根据本发明的一个优选的实施方案，在步骤a)之前 进行至少一个提取所述液体生物学样品中包含的核酸的提取步骤。
[0033] 根据前述任一实例，所述扩增引物对于转变的感兴趣的核酸或者与其互补的那些 核酸具有特异性。
[0034] 根据本发明方法的第二个实施方案，所述检测探针对于转变的祀核酸及扩增子具 有特异性。
[0035] 在所有前述实例及根据一个特定的实施方案，由Ξ种不同类型的碱基组成的所述 引物和/或探针含有至少一个修饰的核巧酸。
[0036] 根据最后的实施方案，所述修饰的核巧酸选自α-寡核巧酸、PNA、LNA、2 ' -0-烷基核 糖核巧酸。
[0037] 根据运个最后的实施方案，所述修饰的核巧酸是2'-0-甲基核糖核巧酸。
[0038] 在所有前述实例中，使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的转变是通过 含硫化学剂的作用实现的。
[0039] 在所有前述实例中，使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的化学剂含有 亚硫酸氨根离子（HS03-)，如亚硫酸氨钢（NaHS〇3)、亚硫酸氨锭（NH4HS03)、亚硫酸氨儀 (Mg服〇3)、焦亚硫酸钢(化2S2O日）、亚硫酸氨钢（sodium hy化ogen sulfite)或者亚横酸。
[0040] 根据所述方法的另一实施方案，使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的 酶剂是胞喀晚脱氨酶。
[0041] 根据所述方法的另一实施方案，所述化学或者酶促处理包括使一种类型的碱基转 变为尿喀晚化)。
[0042] 根据所述方法的再一实施方案，所述化学或者酶促处理包括使胞喀晚(C)转变为 尿喀晚化）。
[0043] 根据所述方法的运个最后的实施方案，与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由 腺嚷岭(A)、胞喀晚(C)和/或胸腺喀晚(T)形成，W及与所述第一引物延伸所得的链杂交的 第二引物由腺嚷岭(A)、鸟嚷岭(G)和/或胸腺喀晚(T)形成。
[0044] 可W使用酶剂代替化学剂，所述酶剂可W使得一种类型的碱基转变为另一种类型 的碱基;运种酶剂优选是腺巧脱氨酶。
[0045] 根据运个最后的新实施方案，所述酶促处理包括使腺嚷岭(A)转变为次黄嚷岭。
[0046] 在酶剂的情况中，与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嚷岭(A)、胞喀晚 (C)和/或鸟嚷岭(G)形成，W及与所述第一引物延伸所得的链杂交第二引物由胞喀晚(C)、 鸟嚷岭(G)和/或胸腺喀晚(T)形成。
[0047] 无论使用上述何种方法，W及根据第一个实施方案，进行的扩增是RT-PCR扩增。
[0048] 无论使用上述何种方法，W及根据第二个实施方案，进行的扩增是对单链进行的 PCR扩增。
[0049] 无论使用上述何种方法，W及根据第Ξ个实施方案，进行的扩增是对双链进行的 PCR扩增。
[0050] 在后者的情况中，所述扩增是利用特异于转变的感兴趣的核酸的每条链的两对扩 增引物实现的。
[0051] 无论使用上述何种方法，W及根据第四个实施方案，进行的扩增是转录后扩增，如 NASBA 或者 TMA。
[0052] 在所有上述情况中，感兴趣的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。
[0053] 本发明还设及用于实施上述方法的试剂盒，特征在于其包含：
[0054] a.使得所述感兴趣的核酸的至少一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的物 质；
[0055] b.扩增引物，及任选存在的检测探针，其适合于转变的感兴趣的核酸或者产生的 扩增子，运些序列由Ξ种不同类型的碱基组成；
[0056] C.扩增及任选地检测需要的试剂，如水溶液、溶剂、核巧酸、酶。
[0057] 根据所述试剂盒的一个实施方案，所述转变物质选自亚硫酸氨钢(化HS化）、亚硫 酸氨锭（NH4HSO3)、亚硫酸氨儀（M巧S〇3)、焦亚硫酸钢（Na2S2〇5)、亚硫酸氨钢（sodium hy化ogen sulfite)或者亚横酸。
[0058] 根据所述试剂盒的另一个实施方案，所述物质选自腺巧脱氨酶或者胞喀晚脱氨 酶。
[0059] 本发明最后设及上述方法或者上述试剂盒在扩增和检测真细菌和/或真菌和/或 病毒和/或酵母祀中的应用。
[0060] 根据不同的应用，所述扩增引物特异于细菌的属，且每种检测探针特异于至少一 个菌种。
[0061 ]如下术语可W单数或者复数形式任意使用。
[0062] 术语"试剂"、"扩增试剂"、"提取试剂"或者"纯化试剂"或者"原材料"是指运样的 试剂，如进行核酸提取、纯化或者酶促扩增反应所需的反应缓冲液、酶、一憐酸核巧、溶剂、 ±h πττ. ο
[0063] "容器"或者"塑料容器"在本发明中是指任何容器，如试管、锥形瓶或者移液器吸 管尖，无论其是否是塑料(例如化pendorf管)还是玻璃或者任何其他材料。
[0064] "核酸"在本发明中是指至少两个核巧酸的序列，优选选自如下四种类型遗传密码 核巧酸的至少十个核巧酸，即
[0065] 如果所述核酸是DNA，则选自：
[0066] dAMP (脱氧腺巧5'-一憐酸）
[0067] dGMP(脱氧鸟巧5'-一憐酸）
[006引 dTMP(脱氧胸巧5'-一憐酸），w及
[0069] dCMP(脱氧胞巧5'-一憐酸）；
[0070] 如果所述核酸是RNA，则选自：
[0071] AMP(腺巧 5'-一憐酸）
[0072] GMP(尿巧 5'-一憐酸）
[0073] IMP(尿巧 5'-一憐酸），W及
[0074] CMP (胞巧 5'-一憐酸）。
[00巧]所述核酸也可任选地包含至少一个肌巧和/或至少一个修饰的核巧酸。术语"修饰 的核巧酸"在本发明中是指运样的核巧酸，例如具有修饰的碱基、脱氧尿巧、二氨基-2,6-嚷 岭、漠-5-脱氧尿巧或者任何其它修饰的碱基的至少一种核巧酸，优选除了 5-甲基胞喀晚之 夕K所述核酸也可W在核巧酸间键水平修饰，如硫代憐酸醋、H-憐酸醋、烷基憐酸醋，在主链 水平修饰，如α-寡核巧酸（FR-A-2,607,507)或者聚酷胺核酸（PMAKEgholm M.et al.; J. Am. Chem. Soc. ; 1992; 114; 1895-97)或者2 ' -0-烷基-核糖核巧酸和/或2 ' -0-氣代核巧酸 和/或2'-胺核巧酸和/或阿拉伯糖核巧酸，W及LNA(Sun B.W.et al.，Biochemist巧；2004; Apr 13; 43 (14): 4160-69)。在2 ' -0-烷基-核糖核巧酸中，优选2 ' -0-甲基-核糖核巧酸，但是 也可W使用5-丙烘基喀晚寡核巧酸（Seitz 0.,Angewandte Chemie International Edition 1999;38(23);Dec:3466-69)。
[0076] 术语"核巧酸"是指核糖核巧酸或者脱氧核糖核巧酸。
[0077] 在本发明中，"生物学样品"或者"液体生物学样品"是指可含有核酸的任何样品。 后者可提取自患者的组织、血、血清、唾液或者循环细胞，或者可W衍生自农产品或者食物 产品，或者可W源于环境。提取是通过本领域技术人员已知的任何方案进行，例如根据专利 EP-B-0，369，063所述分离方法进行。
[0078] "污染物"或者"污染酸"或者"污染核酸"或者"污染成分"在本发明中是指其扩增 是不希望的且在检测期间可产生假阳性结果的任何核酸。
[0079] 术语"亚硫酸氨盐(bisulfite)"在本发明中是指其反应组分是亚硫酸氨根离子的 任何化学试剂。本领域技术人员能例如使用亚硫酸氨钢(化服化）、亚硫酸氨锭(畑4服〇3)、亚 硫酸氨儀(M巧S〇3)、焦亚硫酸钢(化2S2O日）、亚硫酸氨钢（sodium hy化ogen sulfite)或者亚 横酸作为所述化学试剂。优选所述化学试剂是焦亚硫酸钢。
[0080] "扩增"或者"扩增反应"是指本领域技术人员熟知的任何核酸扩增技术，如：
[0081 ] -PCR(聚合酶链反应），在专利US-A-4，683，195、US-A-4，683，202和US-A-4，800， 159中描述，W及其衍生的RT-PCR(逆转录PCR)，尤其是一步形式的RT-PCR，其在专利6?-8- 0，569，272中描述。优选使用单一引物对对单链进行PCR。
[0082] -LCR(连接酶链反应），例如在专利申请EP-B-0，201，184中掲示，
[0083] -RCR(修复链反应），在专利申请W0-A-90/01069中掲示，
[0084] -3SR(自主序列复制），在专利申请W0-A-90/06995中描述，
[0085] -NASBA(基于核巧酸序列的扩增），在专利申请W0-A-91/02818中描述，
[0086] -TMA(转录介导的扩增），在专利US-5，399，491中描述，和
[0087] -RCA(滚环扩增），在专利US-6，576，448中描述。
[0088] -RT-PCR(逆转录聚合酶链反应）。
[0089] 在本发明中，"祀"或者"核酸祀"或"核祀(nucleic ta巧etr或者"感兴趣的祀"或 者"感兴趣的核酸"是指待扩增和/或检测的核酸(寡核巧酸、多核巧酸、核酸片段、核糖体 RNA、信使RNA、转移RNA)。所述祀可W自细胞提取或者化学合成。所述祀可W游离于溶液中 或者可W结合固体支持物。
[0090] 术语"溶液"是指均质或者异质水溶液。
[0091] "固体支持物"是指颗粒，其可W是橡胶、玻璃(CPG)、二氧化娃、聚苯乙締、琼脂糖、 琼脂糖（Sepharose)、尼龙等。运些材料可任选使得磁性材料包囊。其也可W是滤膜、薄膜、 膜或者条带。运些材料为本领域技术人员熟知。
[0092] 祀可W是WDNA和/或RNA的单链或者双链形式存在于混合物中的病毒、细菌、真菌 或者酵母的核酸。通常地，所述祀的长度在50-10000个核巧酸之间，但是最通常在100-1000 个核巧酸之间。
[0093] 术语"天然祀"，称作CNT，在本发明中是指待扩增的祀核酸，由至少四种核巧酸的 核巧酸序列组成，所述核巧酸的碱基是四种不同类型的碱基，选自：腺嚷岭、鸟嚷岭、胞喀晚 和胸腺喀晚(对于DNA而言）或者尿喀晚(对于RNA而言）。任选地，可W存在如先前所述修饰 的核巧酸。当然，使得CNT扩增的所谓的天然引物被称作PNT1和PNT2。如果同时存在几个扩 增，则所述引物例如被称作PNTla和PNT2a(对于第一对引物)及PNT化和PNT2b(对于第二对 引物)。
[0094] 术语"转变的祀"或者"四种碱基的祀"称作C4B，是指祀或者祀核酸已经用化学剂 或者酶剂处理，使得由核巧酸携带的一种类型的碱基转变为另一种不同类型碱基。核巧酸 的数目和顺序不被所述化学剂或者酶剂的作用改变。所述转变的祀核酸(C4B)因此具有与 未转变的祀核酸(CNT)相同的核巧酸总数，但是由其中至少一种类型的碱基被改变为另一 种类型的碱基的核巧酸序列组成。优选地，所述转变的祀由具有选自如下类型的碱基的核 巧酸序列组成:腺嚷岭、胸腺喀晚、鸟嚷岭、尿喀晚、胞喀晚和次黄嚷岭。
[00M]所述四种碱基祀可因此是已经由亚硫酸氨盐转变的待扩增的祀核酸，即：
[0096] ?腺嚷岭、鸟嚷岭和胸腺喀晚未改变，但是胞喀晚被转变为尿喀晚（对于DNA而 言)。
[0097] ?腺嚷岭、鸟嚷岭和尿喀晚未改变，但是胞喀晚也被转变为尿喀晚（对于RNA而 言）。在运种情况中，所述转变使得可W获得具有Ξ种碱基的转变的祀，天然存在的尿喀晚 保持未改变，而胞喀晚被转变为尿喀晚。该RNA由仅具有Ξ种类型碱基的核巧酸序列组成， 即腺嚷岭、鸟嚷岭和尿喀晚。
[0098] 为了简化使用的术语，术语C4B用于描述转变的DNA祀（四种碱基），但是也用于描 述转变的RNA祀(Ξ种碱基）。在任何情况中，运不影响使用上游引物称作P3B1及下游引物称 作P3B2的特异性引物从C4B开始的祀核酸的扩增，所述扩增子C3B总是具有Ξ种碱基（见下 文）。同样，在多重扩增的情况中，所述特异性引物被称作P3Bla和P3Blb(对于上游引物而 言），及被称作P3B2a和P3B2b(对于下游引物而言）。
[0099] 运种转变可应用胞喀晚脱氨酶，其中：
[0100] ?腺嚷岭、鸟嚷岭和胸腺喀晚不改变，但是胞喀晚被转变为尿喀晚（对于DNA而 言)。
[0101] ?腺嚷岭、鸟嚷岭和尿喀晚未改变，而胞喀晚也被转变为尿喀晚（对于RNA而言） (见专利EP-B-1，654,388所述）。在运种情况中，转变使得可W获得具有Ξ种碱基的转变的 祀，天然存在的尿喀晚保持未改变，而胞喀晚被转变为尿喀晚。该RNA由仅具有Ξ种类型碱 基的核巧酸序列组成，即腺嚷岭、鸟嚷岭和尿喀晚。同样，为了简化所用术语，术语C4B也用 于描述转变的RNA祀。在任何情况中，运不影响使用上游引物称作P3B1及下游引物称作P3B2 的特异性引物从C4B开始的祀核酸的扩增，所述扩增子C3B仍然具有Ξ种碱基(见下文）。
[0102] 运种转变可应用腺巧脱氨酶，其中：
[0103] ?胞喀晚、鸟嚷岭和胸腺喀晚不改变，但是腺嚷岭被转变为次黄嚷岭(对于DNA而 言)。
[0104] ?胞喀晚、鸟嚷岭和尿喀晚不改变，但是腺嚷岭被转变为次黄嚷岭（对于RNA而 言)。
[0105] 就此可W提及文献Gerber A.P.et al.Science;1999;Nov 5;286(5442):1146- 49。
[0106] 术语"Ξ种碱基的祀"称作C3B，在本发明中是指利用上游（或者正向）引物称作 P3B1W及下游(或者反向）引物称作Ρ3Β2的特异性引物从C4B中扩增的祀核酸，如下文描述。
[0107] 术语"碱基的类型"是指碱基的种类，即腺嚷岭(Α)、或者胸腺喀晚(Τ)、或者胞喀晚 (C)、或者鸟嚷岭(G)、或者尿喀晚(U)，或者次黄嚷岭，不论事实其与核糖相关(任选是取代 的，例如通过2 甲基基团的存在）W及任选具有1、2或者3个憐酸基团。
[0108] "Ξ种碱基的引物"称作Ρ3Β1和Ρ3Β2,在本发明中是指由修饰或未修饰的至少Ξ种 核巧酸组成的单链核巧酸序列，由选自腺嚷岭、胸腺喀晚、鸟嚷岭、胞喀晚的Ξ种不同类型 碱基组成。所述Ξ种碱基的有义引物(Ρ3Β1)与转变的祀核酸(C4B)的至少一部分序列互补， 或者与自反义引物开始合成的核酸(扩增子)的至少一部分核巧酸序列互补，并且在存在扩 增试剂条件下作为核酸合成的起始点。所述反义Ξ种碱基的引物(Ρ3Β2)与从有义引物合成 的核酸的至少一部分核巧酸序列互补。运些引物的大小在10-100个核巧酸之间，优选在12- 50个核巧酸之间，更优选在15-30个核巧酸之间。
[0109] 根据使用的扩增技术，除了与转变的祀的杂交序列之外，在NASBA或者ΤΜΑ型转录 后扩增的情况中，引物还可包含启动子(例如Τ3、?7或者SP6)的核巧酸序列。本领域技术人 员熟知在运些转录后扩增的情况中，引物由运样的序列的一部分组成，即所述序列的核巧 酸序列由四种不同类型碱基的核巧酸组成（启动子序列），W及所述序列的核巧酸序列由Ξ 种不同类型碱基的核巧酸组成(使得引物与转变的祀杂交的序列）。
[0110] "检测探针"或者"探针"称作SNT，是指选自腺嚷岭、胸腺喀晚、鸟嚷岭、尿喀晚、胞 喀晚的四种不同类型碱基的核巧酸序列的核酸序列，其能与扩增子特异性杂交且携带至少 一种标记物。所述探针可W是圆形探针(称作0-探针，见本
【申请人】在2008年7月4日提交的专 利申请FR08/54549)、分子信标、了泌imatt露探针或者FRET探针。后Ξ种类型的探针为本领域 技术人员熟知。运些探针可任选完全或者部分由修饰的核巧酸组成。每种探针具有一种标 记物及任选一种巧灭剂。
[0111] "标记物"是指由核巧酸携带的分子。所述标记物与核巧酸之间的键合可W通过本 领域技术人员已知的各种方式实现。人工偶联是使用携带活性基团、典型为簇基或者硫醇 的标记物进行，其与修饰携带相应反应基团（例如胺或者硫醇）的修饰的内部核巧酸偶联， 或者与用运些相同的反应基团修饰的核巧酸链的一端偶联。自动偶联是使用携带所述标记 物的亚憐酷胺进行，然后根据使用的亚憐酷胺的类型在核巧酸链的自动合成期间与链的一 端或者与内在部位发生偶联。所述标记物可W是巧光团或者巧光巧灭剂。
[0112] "巧光团"是指当通过适当波长的光激发时发出巧光信号的分子。所述巧光团特别 地可W是罗丹明（rhodamine)或者衍生物如德克萨斯红（Texas Red)、巧光素或者衍生物 (例如FAM)、Alexa家族巧光团如Alexa 532和Alexa 647、Alexa 405、Alexa 700、Alexa 680、切5或者根据使用的测量仪器的合适的任何其它巧光团。可用于检测探针的巧光团非 常各式各样并且为本领域技术人员已知。
[0113] 在本发明中，"巧光素"是指芳香族化学分子，当其由490-5(K)nm波长、优选495nm波 长的光激发时发出巧光信号，最大发射在大约530nm。
[0114] "巧光巧灭剂"或者"巧灭剂"是指干扰巧光团发出巧光的分子。运种巧灭剂可选自 非巧光芳香族分子，W避免寄生发射。优选地，所述巧灭剂是化bsyl或者化bcyl或者"Black hole quencher?"(Bffii)，其是非巧光芳香族分子，当其物理上接近巧光团时阻止巧光发射。 也可W使用巧光共振能量转移（FRET)技术，如Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes，p.4，Ed.V.V.Didenko，Humana Press 2006JSSN 1064-3745所述。所述巧灭 剂也可W选自巧光分子，如TAMRA(簇基四甲基若丹明）。
[0115] "Ξ种碱基的检测探针"或者"Ξ种碱基的探针"称作S3B，是如前述的探针，并且其 除了前述特性之外，还是由选自腺嚷岭、胸腺喀晚、鸟嚷岭、胞喀晚的Ξ种不同类型碱基的 核巧酸序列组成。本领域技术人员易于理解，根据探针的形式(分子信标(Beacon)，0-探针 等），所述探针由运样的序列的一部分组成，即所述序列的核巧酸序列由四种不同类型碱基 组成，W及所述序列的核巧酸序列由Ξ种不同类型碱基组成(使得扩增子杂交和检测的序 列）。
[0116] 在某些情况中，为了改良与扩增子的杂交及因此的检测，如果必要则本发明的探 针可含有尿喀晚代替胸腺喀晚。在运种情况中，本发明的探针由具有四种不同类型碱基(尿 喀晚、鸟嚷岭、腺嚷岭、胸腺喀晚）的核巧酸序列组成。为了简化使用的术语，术语"Ξ种碱基 的探针"或者S3B也用于描述需要更好杂交的运种类型的探针。在任何情况中，运不影响C3B 扩增子和/或互补链C3Bc的检测，所述C3B和C3Bc扩增子总是具有Ξ种碱基(见上文所述）。
[0117] 为了更好地理解本发明的原理，我们采用了其假定序列如下所示(SEQ ID No. 1) 的祀作为实例，其相应于CNT。在用亚硫酸氨盐转变的范围内，所述4种碱基的祀、3种碱基的 祀W及引物和探针具有如下序列：
[0118] · CNT:5'-ATCGAAATTTCCCGGGATCG-3'，沈Q ID No.1
[0119] · C4B:5'-ATUGAAATTTUUUGGGATUG-3'，沈Q ID No.2
[0120] · P3B1:3 '-TAAC-5 '，SEQ ID No.3
[0121] · C3B:3 '-TAACTTTAAAAAACCCTAAC-5 '，SEQ ID No.4
[0122] · P3B2:5 '-ATTG-3 '，沈Q ID No.5，W及
[0123] · S3B:3'-AAAAAA-5'，沈Q ID No.6。
[0124] C3B因此与C3Bc互补：
[01 巧] · C3B:3'-TAACTTTAAAAAACCCTAAC-5'，SEQ ID No.4 [01 %] · C3Bc:5'-ATTGAAATTTTTTGGGATTG-3'，沈Q ID No.7
[0127] 其与CNT完全不同：
[0128] · CNT: 5，-ATCGAAATTTCCCGGGATCG-3，，沈Q ID No. 1 [01 巧] .C3Bc: 5，-ATTGAAATTTTTTGGGATTG-3，，沈Q ID No. 7
[0130] "杂交"是指运^的过程此期1?在合适条件下，具有完全或者部分互补序列的 两个单链核巧酸片段能形成由核酸碱基之间的氨键稳定的双链或者"双链体"。所述杂交条 件由严格性确定，即严格和低盐度运行条件。当用较高严格性条件进行时，杂交的特异性增 加。严格性特别地定义为探针/祀双链体的碱基成分的函数W及通过两个核酸之间的错配 而定义。严格性也可W是反应参数的函数，如杂交溶液中存在的离子的浓度和类型、变性剂 的性质和浓度和/或杂交溫度。其中杂交反应必定进行的条件的严格性主要依赖于使用的 杂交探针。所有运些数据均为本领域技术人员熟知，且可W由技术人员确定适当条件。
[0131] 术语"Ceq"定义为细胞当量，是在真细菌PCR扩增中使用的一个单位，其相应于 1000拷贝的DNA。一个细胞可含有大约103个拷贝的RNA16S(真细菌引物和探针的祀）。
[0132] 实施例和附图代表本发明的具体实施方案，不限制本发明的范围。
[0133] -图1示出在扩增之前应用亚硫酸氨钢转变核酸祀的步骤的优势。如果扩增是常规 进行的，即使用天然祀(未转变的祀，在图中被称作天然的或者CNT)及使用正常核巧酸引物 (在图中被称作PNT1和PNT2)进行，则扩增混合物中天然存在的污染物任选与感兴趣的祀共 扩增。相反，如果在图中被称作C4B的祀在扩增之间被转变，W及使用针对转变的祀设计的 被称作P3B1和P3B2的Ξ种碱基的核巧酸引物进行扩增，则仅运个特定祀将被扩增和检测。 尽管仍存在于溶液中，但是污染物不能被扩增。事实上，本发明的引物，Ξ种碱基的引物 P3B，不能与具有四种不同类型碱基的的核巧酸的污染核酸杂交，甚至不能非特异性杂交。 从转变的祀C4B开始的扩增反应提供在图中被称作C3B的扩增子，然后提供与C3B链互补的 C3Bc。本发明对于细菌、真细菌、真菌、泛真菌、病毒或者酵母的祀的扩增(NASBA、PCR、RT- PCR、TMA等)特别有益。
[0134] -图2描述了使得胞喀晚碱基转变为尿喀晚碱基的化学反应（根据化yatsu H.; Mut. Research; 2008; 659:77-82所述进行）。
[0135] -图3示出通过具有电喷雾离子化化SI)的质谱分析对DNA组分的分析谱。运个分析 在由亚硫酸氨钢转变之前(a)和之后(b)对DNA祀进行。横坐标示出W分钟表示的时间，纵坐 标示出任意单位的吸光度。M+H值表示分子的分子量，其中加入了 1摩尔质子的质量。例如， 脱氧胞喀晚的存在通过出现相应于运个分子的质量而证实。
[0136] -图4是在用不同类型扩增引物(如前述PNT或者P3B)进行的真细菌NASBA扩增中阴 性对照(所述祀用水代替）的对比。扩增子的检测通过测量在488皿的巧光而实时实现，所述 巧光W任意单位(相对巧光单位RFU)在纵坐标上示出；横坐标示出W分钟表示的经过时间 (elapsed time)。实验条件(a)相应于用引物(PNT)和天然检测探针（SNT)进行的阴性对照 的扩增和检测。实验条件(b)相应于用Ξ种碱基的引物(P3B)和Ξ种碱基的检测探针（S3B) 进行的阴性对照的扩增和检测。
[0137]-图5是当转变的祀是双链DNA时根据本发明原理的PCR扩增示意图。需要两个引物 对P3B进行该扩增。
[013引-图6示出在真细菌NASBA扩增中系列稀释的祀的对比。扩增子的检测通过在488nm 测量作为时间(分钟，横坐标)的函数的巧光(任意单位RFU，纵坐标)而实时实现。
[0139] .图6A:由四种不同类型碱基组成的合成祀(CNT)的〇-1〇67拷贝的稀释系列的扩 增（引物PNT)和检测(探针SNT)。
[0140] ?图6B:由Ξ种不同类型碱基组成的合成祀(C3Bc)的0-1(Τ7拷贝的稀释系列的扩 增（引物Ρ3Β)和检测(探针S3B)。
[0141] -图7示出真细菌PCR扩增。扩增子的检测通过在每个循环结束时测量在488nm的巧 光(任意单位RFU)而实现。横坐标示出循环次数，纵坐标示出任意单位的巧光。
[0142] ?图7A:由四种不同类型碱基组成的合成祀(CNT)的0-10巧拷贝的稀释系列的扩 增（引物PNT)和检测(探针SNT)。
[0143] ?图7B:由Ξ种不同类型碱基组成的合成祀(C3Bc)的0-10巧拷贝的稀释系列的扩 增（引物P3B)和检测(探针S3B)。
[0144] -图8示出大肠杆菌的曲NA的系列稀释物的真细菌PCR扩增。扩增子的检测如已经 提及的通过在每个循环结束时测量在488nm的巧光而实现。如前所述，横坐标示出循环次 数，纵坐标示出任意单位的巧光。
[0145] ?图8Α:0-1(Τ5拷贝的大肠杆菌的曲NA的稀释系列的扩增（引物PNT)和检测(探针 SNT)〇
[0146] .图8B:通过用亚硫酸氨盐处理而转变的0-10巧拷贝的大肠杆菌的曲NA(C4B)的 稀释系列的扩增（引物P3B)和检测(探针S3B)。
[0147] 参考图1和图2,更准确地，如下所述进行通过亚硫酸氨钢对祀进行转变。运是包括 四步骤的方案：
[0148] (1)首先，转变自用氨氧化钢(化0H)使所述祀变性开始，然后加入亚硫酸氨钢和氨 酿(后者可限制亚硫酸氨盐的氧化）。
[0149] (2)然后通过柱过滤纯化所述祀。
[0150] (3)在碱性介质中对所述祀进行脱横酸化。
[0151] (4)最后，最后的柱纯化提供准备扩增的转变的祀。
[0152] 现有技术领域已知通过亚硫酸氨盐对核酸的化学转变。关于此，发现如下证据：
[0153] 1)由化apiro及由化yatsu进行的非常早期的工作，其中：
[0154] · "Reaction of Cytosine and Uracil with sodium bisulfite"Shapiro R.et al.J.Biol.Chem.;1973;Jun;248:4060-64,
[0155] · "The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine"Hayatsu H.et al.,J.Am.Qiem.Soc.;1970;40(26):724-26。
[0156] 运证明了在运个领域已经公布了许多文献，但是在那时未确切定义诊断学应用。
[0157] 2)设及用亚硫酸氨盐处理DNA的专利申请，使用非简并引物扩增属于同一原始种 的一套核酸：
[015 引?细菌(W0-A-2006/058393 和 W0-A-2007/140506)，
[0159] ?病毒(W0-A-2007/030882)。
[0160] 3)用亚硫酸氨盐处理核酸W检测DNA基因组序列的甲基化基序的方法的改良，" High Sensitivity mapping of methylated cytosines"by Clark S.J.,Nucleic.Acids Res.；1994August 11；Vol.22(15):299〇-97〇
[0161] 4)用亚硫酸氨盐处理核酸的新开发的方法，所述处理适合固定在固体支持物上的 核酸化P-B-1，590，362和EP-A-1，394，173)。
[0162] 5)概括本领域用亚硫酸氨盐处理核酸W对基因组DNA进行测序及鉴别甲基化胞喀 晚基序状况的出版物。运个概要由亚硫酸氨盐技术的开发者描述：Hayatsu H.， Mut. Research；2008；659:77-82 〇
[0163] 因此明了使用亚硫酸氨盐进行转变的化学在35年前已经充分描述。相反，用于在 祀核酸的提取、纯化和扩增期间使用的试剂所致污染核酸的化学或者酶促转变方法确定未 描述或者甚至未提及。
[0164] 我们的发明因此设及转变的祀的特异性扩增，而无由于污染核酸所致的背景噪 音。
[0165] 本发明的目的因此是提供具有如下优势的一种方法：
[0166] 1)简便且快速，
[0167] 2)就在扩增步骤之前可使用，
[016引3)能W高产量转变祀，
[0169] 4)与众多的扩增技术包括PCRW及所谓的转录后扩增(NASBA和TMA)相容，
[0170] 5)可W自动进行，且可W适合固体和/或磁性支持物。
[017。实嫌例】；通过亚硫酸氮盐转变核酸靴的证实
[017。 目的:
[0173] 为了证实亚硫酸氨盐使具有四种不同类型碱基A、T、G、C的生物学祀（即A(腺嚷 岭）、Τ(胸腺喀晚）、G(鸟嚷岭)和C(胞喀晚））转变为具有四种碱基A、T、G和U(尿喀晚）的祀。
[0174] 程序:
[01 巧]所述转变是使用商购试剂盒ZYM0-EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，ZYM0 Research,#D5005(0range,CA 92867-United States of America),根据该试剂盒提供的 方案进行。
[0176] 被转变的祀是从大肠杆菌〇157，#IRMM449-化A，Sigma-Al化ich 化imie(L'Isle d'Abeau化esnes-FRANCE)中提取的具有500-4000个双链核巧酸的基因组DM商购样品。
[0177] 通过亚硫酸氨盐转变:根据所述试剂盒提供的方案，将13化1的CT转化试剂加入20 μ1样品（相应于从大肠杆菌中提取的200ng基因组DNA)中。将混合物在98°C保溫10分钟，W 使大肠杆菌的基因组祀变性，然后在64°C保溫150分钟及在4°C保溫5分钟（Thermocycler Applied Biosystems GeneAmp 9700,Foster City,U.S.A.)。由此提供了含有转变的革己的 溶液。
[0178] 纯化:将在该试剂盒中被称作结合缓冲液的60化1固定缓冲液加入15化1含有转变 的祀的溶液中。将该混合物置于所述试剂盒提供的柱上，并在l〇,〇〇〇Xg离屯、30秒。将10化1 体积的洗涂缓冲液置于柱上，在12，000 X g离屯、30秒。
[0179] 脱横酸化:将20化1体积的脱横酸化缓冲液置于同一柱上，在室溫保溫15分钟，然 后在12，000 X g离屯、30秒。然后通过加入20化1洗涂缓冲液将该柱洗涂两次，及在12，000 X g 离屯、30秒。
[0180] 洗脱:将该柱置于清洁的管中。在该柱的中屯、加入称作M-洗脱缓冲液的10μ1体积 的洗脱缓冲液，在12,000 Xg离屯、30秒。1化1洗脱液含有通过亚硫酸氨盐转变的DNA，准备用 于扩增。
[0181] 然后将转变的大肠杆菌曲NA样品用核酸酶Pl(13U)(N8630-lVL，SigmaAl化ich， St Louis，U.S.A.)和碱性憐酸酶(3U)(P7923-2KU，Sigma A1 化ich，St Louis，U.S.A.)的混 合物在37 °C水解过夜。然后通过HPLC分析水解的基因组DM。
[01剧 HPLC及通过电喷雾离子化质谱分析检测的条件
[0183] 为此，我们使用：
[0184] · WATERS Alliance 2795HPLC链（Milford,Connecticut(CT)USA)，
[01 化] · WATERS XTerra MS C18柱（Milford,CT，USA)4.6X30 2.5μπι，使用在30°C流速 为1ml/分钟（在260nm检测），在lOmM甲酸锭pH 7中的乙腊的线性梯度：0%-5%(4分钟）、 5%-12%(5 分钟）、12%-90%(2 分钟)及 90%-0%(3 分钟）。
[01 化]· PDA 996二极管阵列检测仪，软件Empower第二版(Milford,CT，USA)，
[0187] ?质量检测仪（ZQ Electrospray WATERS((Milford，CT,USA)。
[01则结论:
[0189] 图3(a)示出通过电喷雾离子化化SI)质谱分析对未用亚硫酸氨盐转化的大肠杆菌 中水解的曲NA组分的分析结果。可见四个主要的峰，相应于四种类型的核巧:脱氧腺巧dA、 脱氧胸巧dT、脱氧鸟巧dG、脱氧胞巧dC，及痕量的脱氧肌巧dl。脱氧肌巧来自腺巧脱氨酶对 脱氧腺巧的酶促作用。腺巧脱氨酶是在商业碱性憐酸酶制备物中W痕量水平发现的污染 物。
[0190] 图3(b)示出对在通过亚硫酸氨盐转变后来自大肠杆菌的水解的曲NA的组分的分 析。在此出现一个新的洗脱峰（峰7)，相应于脱氧尿巧dU，W及几乎消失的（quasi- disappearance)dC峰（峰2)。其它洗脱峰（峰3、4和5)未变，相应于dG、dT和dA的存在。运个层 析图示出运个DNA由四种核巧组成，即加、dA、dT和dG。
[0191] 在运个实施例中，运些实验条件中的转变效率是80%。运个效率是待处理的感兴 趣的DNA大小的函数。对DNA的短片段，转变程度(或者效率水平)更高。在我们的实验条件下 处理的DNA是来自大肠杆菌的基因组DNA，即较长的祀DNA，非常难W变性和转变。然而，已经 证实大多数dC转变为加。
[0192] 实施例2;使用四种碱基的(PNT)或者兰种碱基的(P3B)扩增引物从Ξ种或 回却髓基跑合虚苗_塞接昔遭麵称值_-_?逃…祖-_g皿稀释 NASBA扩增
[OIW] 目的:
[0194]为了提供证据，即证实使用Ξ种碱基的引物(P3B1和P3B2)和碱基探针（S3B)进行 的真细菌NASBA可W扩增及特异性检测Ξ种碱基的合成祀，而不扩增天然祀(CNT)，如污染 的细菌祀。
[01Μ]利用四种碱基的检测探针(SNT)或者Ξ种碱基的检测探针(S3B)实现实时检测。 [01%] 程序:
[0197] 运个检验通过进行真细菌NASBA扩增而进行，一方面使用：
[0198] -称作CNT的四种碱基的寡核巧酸祀的稀释系列，四种碱基的引物（称作ΡΝΤ1和 ΡΝΤ2)及四种碱基的检测探针(SNT)，所述四种类型的碱基是A、T、G和C;
[0199] 另一方面使用：
[0200] -称作C3B的Ξ种碱基的寡核巧酸祀的稀释系列，引物(P3B1和P3B2)及可W与C3B 杂交Ξ种碱基的检测探针(S3B)。
[0201] 所述稀释系列是每个检验0-107拷贝的祀。
[0202] 所述寡核巧酸祀、引物和探针W其本身从Eu;rogentec,Seraing,Belgium定制，未 被亚硫酸氨盐转变，并具有如下所示序列：
[0203] |ECNT(SEQ ID No.8)：
[0204] 5'-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGCTACAACTGTCGTCAGCTCGTGTTCCGCGGGATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCT-3',
[0205] 引物PNTl(沈Q ID No.9):
[0206] 5 ' -aattc1:aatacgactcactataggGCGGGACTTAACCCAACATC-3 '
[0207] 引物PNT2(沈Q ID No.lO):
[0208] 5，一邑邑a邑cat邑t邑邑tttaattc邑一3，
[0209] 检测探针SNT(SEQ ID No.ll):
[0^0] 5 ' -FM-Cgatc巧WTCGTCAGCTCGTGTcgatcg-Dabcy 1-3 '，W=2 ' -0-Me-鸟巧。
[0211] 祀C3B(沈Q ID No. 12):
[0212] 5'-TGGAGTATGTGGTTTAATTTGTTATAATTGTTGTTAGTTTGTGTTTTGTGGGATGTTGGGTTAAGT TTTGTAATGAGTGTAATTTTTATTTT-3'
[0213] 引物P3B1(SEQ ID No.l3):
[0214] 5' -aattc1:aatacgactcactataggACAAAACTTAACCCAACATC-3 '
[0215] 引物P3B2(SEQ ID No.l4):
[0216] 5'-GGAGTATGTGGTTTAATTTG-3'
[0217] 检现臘针S3B(沈Q ID No. 15):
[021 引 5 ' -FM-cgatc巧WTTGTTAGTTTGTGTcgatcg-Dabsy 1-3 '，W=2 ' -0-Me-鸟巧。
[0219] 在运些序列中，启动子T7的序列相应于小写字母所示，检测探针是分子信标，环的 序列W大写字母表示，茎的序列W粗体的小写字母表示。
[0220] 根据试剂盒NASBA NucliSENS EasyQ HIV-lvl.2(Ref.285 036，bioM紅ieux, Marcy ΓE：toi 1 e，France)中提供的厂商指导进行NASBA。简而言之，如下所述制备扩增混合 物(Mix)和酶混合物。
[0221] 扩增混合物(8管的量）：
[0222] · NASBA级别的水，称作NASBA水，11.化1，
[0223] .试剂稀释剂:6化1
[0224] ·κα:12^
[0225] ?试剂的sphere: Isphere
[0226] ?引物与探针的混合物:祉1。
[0227] 酶混合物(8个试管的量）：
[022引 ?酶稀释剂:45μ1(8个试管），及
[02巧]?酶sphere: Isphere。
[0230] 设置：将10μ1体积的扩增混合物置于0.2-ml试管中，向其中加入扣1体积的祀核 酸。将化1体积的酶混合物置于该管的塞子中。将该管盖上，在65Γ保溫5分钟，然后在4rC 保溫5分钟。将该管不揽拌简短离屯、，W组合运两种混合物，然后在NucliSens EasyQ巧光计 (Ref. 200309 ,bioM紅ieux,Ma;rcy 1 'litoile ,France)中在41 °C保溫90分钟（标准程序QL1- 90)。在反应期间在488nm读取巧光。
[0231] 发现相应于图4曲线(a)的祀CNT的NASBA扩增使污染核酸非常强地扩增，而在在四 种碱基的祀的NASBA扩增情况中，在图4曲线(b)中的该信号保持非常弱。运个结果证实几乎 没有引物P3B1和P3B2对污染物的扩增，及几乎没有通过探针S3B对其检测。
[0232] 图6A示出使用引物PNT1和PNT2进行的NASBA扩增没有使得特定祀CNT(每个检验的 浓度为0-1 〇7个拷贝）与阴性对照组(每个检验0个拷贝）有所区别。
[0233] 相反，使用引物P3B1和P3B2对Ξ种碱基的祀C3B进行的NASBA扩增（图她良好的 检测灵敏性给出的特定祀C3B的稀释系列。在运个实施例中，灵敏性是每个检验103个拷贝。 [OZ34]结论:
[0235] 验清晰示出运种对Ξ种碱基的祀的扩增的益处，使得祀的检测灵敏性增加 大约4个对数级。在祀CNT的NASBA扩增中，阴性对照物通过相应于大约1〇67拷贝/检验的信 号鉴别，而在祀C3B的NASBA扩增中运个信号低于1(Τ3拷贝/检验。
[0236] 连施例3;使用ΡΝΤ或Ρ3Β弓懒从兰种或四种碱基的合成氣核昔酸範巧瑜 释系列实施真细菌PCR扩增
[ΟΖ37]目的:
[0238]为了证实在通过使用特异于Ξ种碱基的祀(C3B)的Ξ种碱基的引物(Ρ3Β)进行真 细菌PCR扩增之后，使得Ξ种碱基的合成的细菌祀(C3B)的检测灵敏性相对于通过使用四种 碱基的引物(ΡΝΤ)和四种碱基的探针(SNT)对天然祀(CNT)进行真细菌PCR扩增增加。
[ΟΖ39]程序:
[0240] 使用称作Taqmaii饭、SNT或S3B的巧光检测引物和探针进行真细菌PCR扩增。所述 祀是具有92个核巧酸的合成的寡核巧酸，具有四种碱基的序列(对于CNT是A、T、G、C;SEQID No. 8)或者Ξ种碱基的序列(对于C3B是A、T、G; SEQ ID No. 12)。对0-105拷贝/检验的不同稀 释度的祀进行扩增。
[0241] 根据试剂盒 Ro che Li ghtCyc 1 er Fas t Star t DNA Mas ter Hy probe , # 030003248001(Basle，Switzerland)中提供的厂商指导进行扩增。使用的引物和探针的序 列如下所示：
[02创对天然祀，祀CNT进行PCR:
[0243] ?引物PNTla(SEQ ID No.16):
[0244] 5 '-AGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGG-3 '
[0245] ?引物PNT2a(SEQ ID No.l7):
[0246] 5，-TGGAGCATGTGGTTTMTTC-3，
[0247] ?探针Taq-Man饭SNTa(沈Q ID N〇.18):
[0248] 5'-FAM-TWTCGTCAGCTCGTGT-BHQl-3'with W=2'-〇Me-G
[0249] 对Ξ种碱基的祀，祀C3B进行PCR:
[0巧0] ?引物P3Bla(沈Q ID No.19):
[0巧 1 ] 5，-AAAATAAAAATTACACTCATTACAAA-3 '
[0巧2] ?引物P3B2a(沈Q ID No.20):
[0253] 5'-TGGAGTATGTGGTTTAATTT-3'
[0巧4] ?引物TaqMan饭S3Ba(沈Q ID N〇.21):
[0巧5] 5，-FM-TGTTGYYKWYYYGTGT-BHQl-3，，Υ = 2，-OMe-U，W=2，-OMe-G，Κ = 2，-OMe-A。
[0256] 核巧酸2'-0-Me使得可W补偿杂交溫度的丧失(与Ξ种碱基的探针的序列中C碱基 的消失相关）。运个TaqMan?探针的设计中尿喀晚(在运种情况下是修饰的尿喀晚）的点 导入使得可W改良与扩增子的杂交。
[0257] 扩增混合物(一个管）：
[0巧引 ?用于PCR的水：10.化1
[0巧9] ?引物Ρ1(1〇μΜ):化1
[0260] ?引物Ρ2(10μΜ):化1 惦61] ?探针（2.5μΜ):化1
[0%2] · MgCl2(化化 1
[0%3] ?扩增混合物（lOXMaster Mix):化 1.
[0264] 将最终的扩增混合物在95°C预保溫10分钟，然后进行45次循环扩增，所述循环包 括在95°C变性10秒钟，在50°C杂交15秒钟，及在60°C延伸15秒钟。通过在95°C保溫5分钟终 止扩增。在延伸循环期间在530nm读取巧光。
[0265] 图7A示出在低于每个检验103个拷贝CNT祀的条件下，PCR信号与阴性对照(0个拷 贝）的信号不能区分。真细菌PCR对于CNT祀的灵敏性因此是103个拷贝/检验。
[0266] 在图7B中，对Ξ种碱基的寡核巧酸祀(C3B)进行的真细菌PCR示出与阴性对照(0个 拷贝/检验)保持水平曲线的极佳灵敏性，灵敏性高于10个拷贝/检验。
[0267] 结论:
[0268] 验证实对Ξ种碱基的合成祀C3B使用真细菌PCR扩增增加灵敏性4个对数 级。
[0269] Ξ种碱基的祀扩增的灵敏性不依赖于使用的扩增技术和检测方式。运些实验示出 无论使用的扩增技术和Ξ种碱基的检测探针的形式如何，本发明的Ξ种碱基的祀的扩增灵 敏性远高于天然祀(CNT)的常规扩增的灵敏性。
[0270] 集施側4;巧实通过纽菌DNA鞭的转变巧儘巧P3技引物的PCR扩增増化 灵敏性 脚1] 目的:
[0272]在对合成模型(实施例2和3)的证实之后，对通过亚硫酸氨盐实验性转变的真实生 物学模型进行测定。目的是证实细菌祀在转变及使用特异于转变的祀的P3B扩增引物进行 PCR扩增后，检测灵敏性增加。 脚引程序:
[0274] 运个证实是使用商购转变试剂盒(幻mo Research)并根据该试剂盒供应商的指导 进行(参见实施例1)。所述转变是对大肠杆菌(〇157,51旨111曰1觀1449-164)的基因组0魁提取 物进行，其由50-4000个核巧酸的核酸组成。W与实施例3所述那些相同的实验条件、相同引 物和相同检测探针进行真细菌PCR扩增。在延伸循环期间在530nm读取巧光。
[0275] 图8A相应于其中来自大肠杆菌的祀DNA未用亚硫酸氨盐处理的实验条件。该DNA因 此由具有四种不同类型碱基即A、T、G和C的核巧酸序列组成。该DNA的扩增产生由四种不同 类型碱基(A、T、G和C)的序列组成的扩增子。
[0276] 图8B相应于其中来自大肠杆菌的DNA在用亚硫酸氨盐处理后被转变的实验条件。 运种转变的DNA(4种碱基的转变的祀）由具有四种不同类型碱基即A、T、G、U的核巧酸序列组 成。使用本发明的引物(3种碱基的引物)转变的该DNA的扩增产生由具有Ξ种不同类型碱基 A、T、C或者A、T、G的核巧酸序列组成的扩增子。
[0277] 如图8A所示，在来自大肠杆菌的未转变的DNA的真细菌PCR扩增的情况中，灵敏性 水平为lOOOCeq/检验。在OCeq/检验的阴性对照与lOOCeq/检验分不清。运个图示出在低于 100，000个拷贝的祀DNA的阔值下，不能区分祀DNA与使用的各种试剂中存在的污染DNA。
[0278] 图8B示出在通过亚硫酸氨盐对样品进行转变及真细菌PCR扩增之后，获得的灵敏 性水平为0.1-lCeq/检验。阴性对照提供非常弱的信号。运个实验证实本发明的方法使得可 W规避所有污染物，因此获得灵敏性的显著增加。
[0279] 此外，尽管在我们的实验条件下来自大肠杆菌的基因组DNA的转变效率是80% (见 上述），但是检测灵敏性相对较高，且不出现受未转变的20%的大肠杆菌基因组DNA的影响。 因为运20 %的基因组DNA在其碱基类型水平未改变，其自动变成污染物且不被本发明的方 法扩增。
[0280] 结论:
[0281] 对通过亚硫酸氨盐转变的细菌DNA祀进行真细菌PCR扩增的运个实施例清晰证实 通过对样品进行运种处理可W增加灵敏性。事实上，所述灵敏性增加4个对数级。通过应用 预先用亚硫酸氨盐处理的扩增技术，得自阴性对照的信号可W关闭（turned off),即使转 变处理的效率水平未接近100%。
[0282] 因此本发明提供了完全避免在提取、纯化和扩增试剂中存在的细菌污染物的选择 方法。
【主权项】
1. 一种特异性扩增方法在防止含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的 污染物中的用途，所述方法包括如下步骤： a) 对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的 碱基转变为另一种类型的碱基； b) 加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类 型的碱基组成，所述引物包含至少一个选自α-寡核苷酸、PNA、LNA、2 ' -0-烷基核糖核苷酸的 修饰的核苷酸； c) 在这些处理之后，向所述生物学样品加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷 酸、酶，以及预先合成的所述引物； d) 将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增的条件下， 其中所述扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。2. -种特异性检测方法在防止含有希望扩增及检测的感兴趣的核酸的液体生物学样 品中的污染物中的用途，所述方法包括如下步骤： a) 对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的至少一种类 型的碱基转变为另一种类型的碱基； b) 加入扩增引物及检测探针，分别用以扩增及检测从感兴趣的核酸的扩增所获得的扩 增子，每种引物和探针由三种不同类型的碱基组成，所述引物包含至少一个选自α-寡核苷 酸、PNA、LNA、2 ' -0-烷基核糖核苷酸的修饰的核苷酸； c) 向所述生物学样品加入扩增和检测所需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预 先合成的所述引物和探针； d) 将所述溶液和试剂置于使得所述转变的核酸被扩增及产生的扩增子被检测的条件 下， 其中所述扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。3. 权利要求1或2的用途，特征在于在步骤a)和b)之间进行至少一个纯化步骤。4. 权利要求1-3任一项的用途，特征在于在步骤a)之前进行至少一个提取所述液体生 物学样品中包含的核酸的步骤。5. 权利要求1-4任一项的用途，特征在于所述扩增引物对所述转变的感兴趣的核酸或 者与其互补的那些核酸具有特异性。6. 权利要求2的用途，特征在于所述检测探针对所述转变的靶和所述扩增子具有特异 性。7. 权利要求1或2的用途，特征在于所述修饰的核苷酸是2 ' -0-甲基核糖核苷酸。8. 权利要求1-7任一项的用途，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱 基的所述化学处理是通过含硫化学剂的作用实现的。9. 权利要求1-8任一项的用途，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱 基的化学剂含有亚硫酸氢根离子(HSOf)，如亚硫酸氢钠(NaHS0 3)、亚硫酸氢铵(NH4HS03)、亚 硫酸氢镁(MgHS〇3)、焦亚硫酸钠(Na2S2〇5)、亚硫酸氢钠 （sodium hydrogen sulfite)或者亚 磺酸。10. 权利要求1-7任一项的用途，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱 基的酶剂是胞嘧啶脱氨酶。11. 权利要求1-10任一项的用途，特征在于所述化学或者酶促处理包括使一种类型的 碱基转变为尿嘧啶(U)。12. 权利要求1-11任一项的用途，特征在于所述化学或者酶促处理包括使胞嘧啶(C)转 变为尿嘧啶(U)。13. 权利要求12的用途，特征在于与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嘌呤 (A)、胞嘧啶(C)和/或胸腺嘧啶(T)组成，与所述第一引物延伸所得的链杂交的第二引物由 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)组成。14. 权利要求1-7任一项的用途，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱 基的酶剂是腺苷脱氨酶。15. 权利要求14的用途，特征在于所述酶促处理包括使腺嘌呤(A)转变为次黄嘌呤。16. 权利要求14和15的用途，特征在于与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嘌 呤(A)、胞嘧啶(C)和/或鸟嘌呤(G)组成，与所述第一引物延伸所得的链杂交的第二引物由 胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)组成。17. 权利要求1-16任一项的用途，特征在于进行的扩增是RT-PCR扩增。18. 权利要求1-17任一项的用途，特征在于进行的扩增是对单链进行的PCR扩增。19. 权利要求1-17任一项的用途，特征在于进行的扩增是对双链进行的PCR扩增。20. 权利要求19的用途，特征在于所述扩增是通过两对扩增引物实现的，所述引物特异 于转变的感兴趣的核酸的每条链。21. 权利要求1-16任一项的用途，特征在于进行的扩增是转录后扩增，如NASBA或者 TMAo22. 权利要求1-22任一项的用途，特征在于感兴趣的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和/或 核糖核酸(RNA)。23. 试剂盒在防止含有真细菌和/或真菌和/或病毒和/或酵母的核酸的液体生物学样 品中的污染物，以扩增和检测真细菌和/或真菌和/或病毒和/或酵母靶中的非诊断性用途， 其中所述试剂盒包含： a. 使得至少一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的物质； b. 扩增引物及任选存在的检测探针，其适合于转变的感兴趣的核酸或者产生的扩增 子，所述引物和探针由三种不同类型的碱基组成，所述引物包含至少一个选自寡核苷酸、 PNA、LNA、2 ' -0-烷基核糖核苷酸的修饰的核苷酸； c. 扩增所需的试剂及任选存在的检测所需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶， 其中所述扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。
【文档编号】C12Q1/68GK106011310SQ201610370995
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2010年1月4日
【发明人】A·拉尤, A·特勒施
【申请人】生物梅里埃公司