用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于特异性检测人丙型肝炎病毒(HCV)的引物组和/或探针。本发明还涉及包含引物组和/或探针的用于特异性检测人丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于特异性检测样品中丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用引物组和/或探针检测样品中HCV基因的方法。
【专利说明】
用于检测人丙型肝炎病毒的引物组和探针
技术领域
[0001] 本发明设及用于特异性检测人丙型肝炎病毒化CV)的引物组和/或探针。本发明还 设及包含引物组和/或探针的用于特异性检测人丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列。本发明 还设及引物组和/或探针在制备用于特异性检测样品中丙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列中 的用途。本发明还设及使用引物组和/或探针检测样品中HCV基因的方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎的传染源主要为急性临床型和 无症状的亚临床病人、慢性病人和病毒携带者。一般病人发病前12天，其血液即有感染性， 并可带毒12年W上。HCV主要经血源传播，国外30-90%输血后肝炎为丙型肝炎，我国输血后 肝炎中丙型肝炎占1/3。此外还可通过其他方式如母婴垂直传播，家庭日常接触和性传播 等。
[0003] 输入含肥V或HCV-RNA的血浆或血液制品，一般经6-7周潜伏期后急性发病，临床表 现为全身无力，胃纳差，肝区不适，1/3病人有黄痘，ALT升高，抗HCV抗体阳性。丙型肝炎病毒 化CV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，临床丙型肝炎病人50%可发展为慢性肝 炎。甚至部分病人会导致肝硬化及肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大。
[0004] 丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，当HCV在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能 改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明HCV直接损害肝脏，对发病起一 定作用。但多数学者认为细胞免疫病理反应可能起重要作用，发现丙型肝炎与乙型肝炎一 样，其组织浸润细胞WCD3+为主，细胞毒T细胞(TC)特异攻击HCV感染的祀细胞，可引起肝细 胞损伤。
[000引在肥V急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105~107拷贝/ml。在 HCV慢性感染者中，HCV RNA水平在不同个体之间存在很大差异，但同一名患者的血液中HCV RNA水平相对稳定。对抗-HCV阳性的HCV持续感染者，需要通过HCV RNA检测确证。只要一次 病毒定性检测为阳性，即可确证肥V感染，但一次检测阴性并不能完全排除HCV感染，应重复 检查。HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病 毒疗效评估的观察指标。
[0006] 抗-HCV阳性，但反复检测HCV RNA均为阴性:可能为既往HCV感染已自行恢复，或经 治疗病毒已清除；一些自身免疫缺陷病患者可能出现抗-HCV阳性，但肥V RNA始终阴性。HCV RNA阳性，但抗-HCV阴性:可能为HCV感染早期，抗-HCV尚未产生;处于严重免疫抑制状态或 免疫受损(如HIV感染），或接受透析的患者，亦可在肥V RNA阳性的情况下呈抗-HCV阴性。母 体的IgG型抗-HCV可W通过胎盘进入胎儿体内，因此6个月W内的婴儿抗-HCV阳性并不一定 代表HCV感染。应WHCV RNA阳性作为其HCV感染的依据。
【发明内容】
[0007] 发明要解决的技术问题 目前市场上已有的HCV检测试剂盒已不能满足临床诊断治疗的要求，主要表现在W下 几个方面： (1) 灵敏度较低，低于500 lU/ml病毒载量很难检测到，然而丙型肝炎病毒核酸国家参 考品要求灵敏度至少达到50IU/ml; (2) 手工操作，低重现性，非标准化的操作流程极大的影响了病人的治疗效果； (3) 低通量，手动操作时间长，结果报告不及时； (4) 因长期进行抗病毒治疗，产生耐药性，导致假阴性率不断升高。
[000引另外《YY/T 1182-2010核酸扩增检测用试剂盒》行业标准于2012年6月1日开始实 施，其中对皿V、HIV、HCV有要求，（1)加入全程参与的内标；（2)质控品和标准品需要进行核 酸提取和纯化;（3)核酸加样体积不小于20μ1，总反应体积不小于40μ1。
[0009] 为满足临床诊断治疗要求，需要具有灵敏度高、精密度高和假阴性率低的用于检 测人HCV的引物、探针W及包含所述引物和探针的试剂盒。
[0010] 本发明目标在于提供能满足上述要求的用于检测人HCV的引物组、探针W及包含 所述引物组和探针的试剂盒。本发明的引物组和探针可解决因 HCV高突变而产生的漏检问 题，并且具有较高的灵敏度及特异性。
[00川技术方案 本发明设及一种用于检测人丙型肝炎病毒化CV)基因的引物组。在一个实施方案中，所 述引物组包括或者是至少一种选自W下的引物组： (1) 引物组1，其包含具有如SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列的引物和具有如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列的引物;或者由所述引物组成;和 (2) 引物组2,其包含具有如SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列的引物和具有如SEQ ID NO: 5所示的核巧酸序列的引物，或者由所述引物组成。
[0012] 在一个实施方案中，所述引物组包括或者是至少一种选自W下的引物组： (1) 引物组1，其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 2所示的引物;或者由所述引物组成;和 (2) 引物组2,其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 4所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示的引物，或者由所述引物组成。
[0013] 在一个实施方案中，本发明的引物组包括或者是： (1) 引物组1，其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 2所示的引物，或者由所述引物组成;和 (2) 引物组2,其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 4所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示的引物，或者由所述引物组成。
[0014] 本发明还设及一种用于检测人HCV基因的探针。在一个实施方案中，探针包括或者 是至少一种选自W下的探针： (1) 探针1，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列;和 (2) 探针2,其具有如SEQ ID NO: 6所示的核巧酸序列。
[0015] 在一个实施方案中，探针包括或者是至少一种选自W下的探针： (1) 探针1，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 3所示;和 (2) 探针2,其核巧酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0016] 在一个实施方案中，探针包括或者是： (1) 探针1，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 3所示;和 (2) 探针2,其核巧酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0017] 在一个实施方案中，探针通过标记物标记。在一个实施方案中，所述探针的一个末 端(例如5'末端或3'末端)通过报告巧光基团标记，并且探针的另一个末端(例如3'末端或 5'末端)通过泽灭巧光基团标记。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 3所示的探针1的5'末端 由FAM标记并且3'末端由BHQ1标记。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 6所示的探针2的5'末 ?由FAM柄记并且3末?而由B册1柄记。
[0018] 本发明还设及一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其含有本发明的引物 组。在一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1。在又一个实施方案中，本发 明的试剂盒或微阵列包含引物组2。在再一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引 物组及引物组2。
[0019] 本发明还设及一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其含有本发明的探针。 在一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含探针1。在又一个实施方案中，本发明的 试剂盒或微阵列包含探针2。在再一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含探针 及探针2。
[0020] 本发明还设及一种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其含有本发明的引物 组和探针。在一个实施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1和探针1。在又一个实 施方案中，本发明的试剂盒或微阵列包含引物组2和探针2。在再一个实施方案中，本发明的 试剂盒或微阵列包含引物组1和探针及引物组2和探针2。
[0021] 本发明还设及引物组在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵列中的用 途。在一个实施方案中，引物组是至少一种选自W下的引物组：引物组1和引物组2。
[0022] 本发明还设及引物组和/或探针在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵 列中的用途。在一个实施方案中，引物组和探针为引物组1和探针1。在另一个实施方案中， 引物组和探针为引物组2和探针2。在又一个实施方案中，引物组和探针为引物组1和探针1 W及引物组2和探针2。
[0023] 本发明还设及检测样品中HCV基因的方法，所述方法包括： (1) 提取和任选纯化样品中的核酸，和 (2) 使用引物组进行扩增和/或使用探针进行特异性杂交，W检测所述核酸。
[0024] 在一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法包括： (1) 提取和任选纯化样品中的核酸， (2) 使用引物组对从步骤(1)中获得的核酸进行扩增，从而得到扩增产物，和 (3) 使探针与扩增产物进行特异性杂交，W检测所述核酸。
[0025] 在一个实施方案中，步骤(2)和步骤(3)同时进行。在一个实施方案中，检测HCV基 因可为定性检测或定量检测。在另一个实施方案中，检测为定量检测。在又一个实施方案 中，通过RT-PCR法来检测。在再一个实施方案中，检测为通过巧光定量RT-PCR检测。在另一 个实施方案中，检测为通过一步巧光定量RT-PCR检测。
[00%] 在一个实施方案中，核酸包括DNA和/或RNA，优选RNA。
[0027]在一个实施方案中，通过RT-PCR进行扩增反应。在另一个实施方案中，使用巧光定 量RT-PCR法对样品中HCV基因进行定量检测。在又一个实施方案中，使用一步巧光定量RT- PCR法对样品中HCV基因进行定量检测。
[0028] 在一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法所使用的引物组和/或探针包括引 物组1和/或探针1。在另一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法所使用的引物组和探 针包括引物组2和/或探针2。在另一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法所使用的引 物组和探针包括引物组1和探针及引物组2和探针2。
[0029] 在一个实施方案中，样品可来源于动物受试者，例如人受试者。在一个实施方案 中，样品为生物学样品，例如来源于人的生物学样品，包括但不限于体液样品或组织样品。 在一个实施方案中，样品可为受试者的体液，包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、分 泌液、泪液等，优选血液、血清和血浆，和更优选血液。
[0030] 在一个实施方案中，样品可不来源于人受试者或者任何其它动物来源，优选为环 境样品和工业样品。在又一个实施方案中，检测样品中HCV基因的方法可不用于诊断受试者 受到HCV感染，例如可用于检测环境样品和工业样品是否受到HCV污染。
[0031] 在一个实施方案中，样品经过QIAsymphony SP/AS自动化仪器平台处理W提取并 纯化HCV核酸，优选HCV RNA。
[0032] 引物及探针 本发明的引物组包括引物组1和/或引物组2。本发明的探针包括探针1和/或探针2。
[0033] 用于检测人HCV基因的本发明引物组和探针的实例分别见表1和2。
[0034] 表1本发明所用的引物及相应的祀序列
祀序列1对应于引物组1，祀序列2对应于引物组2。探针1可与由引物组1扩增得到的PCR 产物特异性杂交。探针2可与由引物组2扩增得到的PCR产物特异性杂交。
[0035] 本发明的引物和探针的核巧酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增效果 或者探针的杂交效果不受到明显的影响即可。所述修饰可W为例如在核巧酸序列中或两端 添加一个或多个核巧酸残基、在核巧酸序列中缺失一个或多个核巧酸残基、或者将序列中 的一个或多个核巧酸残基替换成另外的核巧酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领 域技术人员清楚，所述修饰形成的引物或探针也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保 护范围之内。在一个实施方案中，引物和探针的核巧酸序列的修饰形式为如CN103270174A 中所公开的化学增强型引物。
[0036] 探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)可通过报告巧光基团标记，并且探针的另 一个末端(例如3'末端或5'末端)可通过相应的泽灭巧光基团标记。一方面，SEQ ID NO: 3 所示的探针1的5 '末端可由FAM标记并且3 '末端可由MGB或BHQl或BHQ2标记。另一方面，SEQ ID NO: 6所示的探针2的5'末端可由FAM标记并且3'末端可由MGB或B册1或B册2标记。
[0037] 可W使用例如通用DNA合成仪(例如由Applied Biosystems制造的394型），经化学 方法合成本发明引物组和探针中的各个核巧酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法 来合成寡核巧酸，例如引物组和探针。
[0038] 使用从样品中提取的HCV病毒核酸作为模板，并使用前述引物组对HCV基因进行扩 增反应，W获得扩增产物。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应 化CP)、自动维持序列复制（3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置 换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)，其公开于W下参考文献(在此引作参考）中:Mullis等，美国 专利第4,683,195号;第4,965,188号;第4,683,202号；第4,800,159 (PCR)号;Gelfand等， 美国专利第5,210,015号（用叮aqman"或"Taq"[注册商标]探针进行的实时PCR);Wittwer 等，美国专利第6，174，670号;Kacian等，美国专利第5，399，491号TNASBA" ); Lizardi，美国 专利第5,854,033号;Aono等，日本专利公开第肝4-262799号(滚环扩增）；等等。
[00例优选使用PCR法对HCV基因进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语"per 包括该反应的衍生形式，其包括但不限于反转录PCR (RT-PCR)、实时PCR、嵌套式PCR、多重 PCR和巧光定量PCR等。优选使用巧光定量RT-PCR法、特别是一步巧光定量RT-PCR法对肥V基 因进行定量检测。
[0040] 样品经过提取并纯化获得HCV RNA后，可使用RT-PCR对肥V RNA进行检测。首先，通 过反转录酶对HCV RNA进行反转录成cDNA。在本发明的HCV检测中，可使用各种常规的反转 录酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶;禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶;嗜热 栖热菌（巧er皿/S iAermo如別化?)、黄栖热菌（巧ermt/s /7aras)等嗜热微生物的热稳定性反 转录酶;MMLV反转录酶的RNA酶Η突变体(商品名为Superscript和SuperScriptll)。然后， 在引物、模板cDNA和耐热DNA聚合酶存在下，使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义 链杂交的引物(正向引物），通过使退火、延伸和变性步骤的循环重复大约30次~50次(例如 45次）来进行PCR。
[0041] 在本发明的HCV检测中，可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，包括但不限 于F'astSta;rtTaqDNA聚合酶（Roche)、ExTaq(注册商标，Takara)、Z-Taq、AccuP;rime Taq DNA聚合酶和Hots化rTaq Plus DNA聚合酶。优选使用HotStarTaq Plus DNA聚合酶。也 可使用市售反转录酶和DNA聚合酶的混合物，例如化eSt邱Enzyme Mix (例如可获自德国 QIAGEN公司）。在存在引物例如本发明引物组的情况下，所述酶混合物可用于在同一管中进 行cDNA的合成和PCR反应，即一步RT-PCR。在存在引物和探针例如本发明引物组和探针的情 况下，所述酶混合物可用于一步巧光定量RT-PCR法，即在同一管中进行cDNA的合成、PCR反 应和PCR产物的检测。
[0042] 基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的，本领域普通技 术人员可W根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等，选出最 佳条件。例如，可使用W下条件进行巧光定量PCR反应:50°C 30分钟，95°C 15分钟，95°C 15 秒，50 °C 45秒，72 °C 15秒，循环45次。
[0043] 可将能够检测HCV的本发明探针与样品中的核酸例如HCV核酸或者由PCR扩增的 DNA产物进行特异性杂交反应，从而实现对扩增产物的定量或定性检测。本发明的探针可通 过标记物进行标记W方便光学仪器检测，标记物例如包括巧光物质和生物素中的任一种。 标记物的实例包括FITC、切3、切5、切5.5、切7、TAMRA、Dab巧1、3(^、了61'、罗丹明、德克萨斯 红、皿X、切ber 0'6611^41、]\?^、8朋1和8朋2等。优选的标记物可包括但不限于。41、]\?；8、 B册1和BHQ2等。通过采用光学检测手段，观察源于运类巧光物质的巧光强度，能够W高灵敏 度检测被用于巧光标记的各种巧光物质。标记物还可包括报告巧光基团和泽灭巧光基团。 报告巧光基团可为例如FAM、肥X或TET;巧灭巧光基团可为例如TAMRA、MGB、B册1或B册2。
[0044] 可采用化qman技术使用本发明的引物组和探针进行PCR检测。TaqMan技术的要点 是在普通PCR原有的特异性引物对基础上增加了特异性的巧光双标记探针。该探针同样与 病原体核酸特异性结合，而且结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5/端和y端分别 标记不同的巧光素，如5/端标记FAM巧光素，它发出的巧光能够被检测仪器接收，称为报告 巧光基团（用R表示），3/端一般标记TAMRA巧光素，它在近距离内能吸收5/端报告巧光基团 发出的巧光信号，称为泽灭巧光基团（用Q表示）。当PCR反应在退火阶段时，引物对和探针同 时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的巧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R 所发出的巧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，W四种核巧酸为 底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，受 到探针的阻碍而无法继续，此时的化q酶发挥它的5/^3/外切核酸酶的功能，将探针切成单 核巧酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的巧光再不为Q所吸 收而被检测仪所接收;在化q酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于 溶液中，仪器可继续检测到R所发出的巧光信号。如上所述，PCR进行一个循环，合成了N条新 链的同时，就水解了 N条探针，亦释放了相应数量的巧光基团。仪器所接收到巧光信号的强 度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，巧 光信号也相应增长。如果W每一个PCR循环结束时所测得的巧光值为纵坐标，WPCR循环数 为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后巧光值的曲线一称为扩增曲线。当检测标 本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈"S"型；而当标本中不含病原体， 贝化CR过程不发生，探针不被水解，不产生巧光信号，其扩增曲线为一水平线。PCR扩增信号 进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阔值 线（Threshold);而扩增曲线与阔值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越 高，Ct值就越小。W此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为巧光PCR 本身先进的巧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可W实现对病原体核酸的定量。
[0045] 样品 本发明所用的样品可W是生物来源、环境来源、医学来源或患者来源的一定量的材料。 一方面，它可包括标本或培养物(例如微生物培养物）。另一方面，它也可包括但不限于生物 学样品和非生物样品（例如环境样品和工业样品等）。生物学样品可包括采自受试者的材 料，其包括但不限于体液样品（例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脈 汁和呼吸液和粘液)和组织样品（例如活组织切片等）。生物学样品可获自人受试者或其它 动物。环境样品是指取自例如自然环境、生活环境、工作环境和生产环境等的样品，包括但 不限于天然食物、表面物质、±壤、水。工业样品是指取自工业制品的样品，包括但不限于从 加工食品和奶制品、加工设备、仪器、装置、器具、一次性用品和非一次性用品中获得的样 品。运些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。
[0046] 从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酪和氯仿进行RNA提 取，或者使用市售RNA提取试剂进行提取。例如，可使用RNA提取试剂盒（例如RNeasy Mini Kit (Qiagen))进行提取。
[0047] 核酸可通过本领域众常规的纯化方法来纯化。本发明优选采用磁珠法核酸纯化技 术实现病毒核酸纯化。在磁珠(纯化)法中，加入蛋白酶使病毒裂解并将病毒DNA或RNA释放 出来，磁珠表面包裹有一层二氧化娃，二氧化娃在高离液剂的条件下特异吸附核酸DNA或 RNA，接着通过洗涂步骤有效去除二价阳离子和蛋白质等PCR反应抑制物，最后用洗脱液(低 盐)将病毒DNA或RNA从磁珠上洗脱下来，完成纯化。经过纯化的病毒DNA或RNA不含蛋白质、 核酸酶和其他杂质，而且回收率高。
[004引本发明可W采用QIAsymphony SP/AS自动化仪器平台进行核酸提取并纯化。
[0049] 试剂盒 本发明设及一种用于检测人HCV基因的试剂盒，其含有本发明的引物组或者引物组与 探针的组合。本发明还设及引物组或者引物组与探针的组合在制备用于检测样品中HCV基 因的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，引物组选自引物组1和引物组2。在一个实施方案 中，所述引物组和探针的组合选自至少一种W下组合：引物组1和探针1的组合，和引物组2 和探针2的组合。
[0050] 试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括引物组和探针）。试剂盒可 W包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、探针、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、 实施检测的说明书等）。例如，试剂盒可W包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材 料的容器(例如盒子）。运样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个容器 可含有用于测定的酶，第二个容器含有引物组，而第Ξ个容器含有探针。所述试剂盒还可含 有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有引物组、探针、PCR反应缓 冲液和使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用于质控的内 标、阳性和阴性对照和/或HCV假病毒标准品等。试剂盒还可包含用于从样品制备HCV RNA的 试剂。本发明试剂盒还可包含除了本发明的引物组和探针之外的其它任何引物组和/或探 针，例如能够有效检测人HCV基因的引物组和/或探针。W上实例不能理解为限制适用于本 发明的试剂盒及其内容物。
[0化1 ]微阵列 本发明设及一种用于检测人HCV基因的微阵列，其含有本发明的引物组和/或探针。本 发明还设及引物组和/或探针在制备用于检测样品中HCV基因的微阵列中的用途。在一个实 施方案中，引物组选自引物组1和引物组2。在一个实施方案中，探针选自探针1和探针2。在 一个实施方案中，引物组和探针的组合选自至少一种W下组合：引物组1和探针1的组合，和 引物组2和探针2的组合。
[0052]微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包 含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核巧酸或多核巧酸的相同的拷贝，所述区域或位 点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠;也就是说，所述区域或位点在空间上是离散 的。此外，空间上确定的杂交位点可为"可寻址的"，因为其位置及其固定化的寡核巧酸的身 份是已知或预先确定的（例如在其使用前是已知或预先确定的）。通常寡核巧酸或多核巧酸 为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的 密度通常大于100/cm2,更优选大于1000/cm2。微阵列技术公开于例如W下参考文献中： Schena编辑的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Qirrent Opin. Qiem. Biol., 2:404-410,1998,其全部内容通过引用结合到 本文中。
[0化3]有益效果 本发明提供了检测限低、假阴性率低、灵敏度高、线性范围宽W及精密度高的用于人 HCV基因检测的引物组和探针、包含它们的试剂盒W及检测方法。
【附图说明】
[0054] 图1表示AB 口 300、AB 口 500、RGQ和LC480四个PCR平台最低检测限的原始数据。A. RGQ仪器，其中左侧窗口为定量检测数据，右侧窗口为内标检测数据;N50为中国食品药品检 定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度为50IU/ml;NC为阴性对 照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。B. AB口300仪器，其中N50和 N100为中国食品药品检定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度 分别为50IU/ml和100IU/ml;NC为阴性对照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为 定量标准品。C. ABI7500仪器，其中N50和N100为中国食品药品检定研究院HCV核酸国家参 考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度分别为50IU/m巧日100IU/ml;NC为阴性对照，HP为 强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。D. LC480仪器，其中N50为中国食品 药品检定研究院HCV核酸国家参考品中的灵敏度参考品稀释的样本，浓度为50IU/ml;NC为 阴性对照，HP为强阳对照，CP为临界阳性对照，QS1-QS4为定量标准品。
[0055] 图2表示本发明试剂盒通过巧光定量PCR检测肥V核酸的线性范围（1X102-5X107 lU/mL)。
[0056] 本发明的目的、特征及优点将结合实施例，参照附图作进一步详细阐述。应当理 解，运些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring化rbor LaboratoiT Press,0989)中所述的条件，或者试剂盒生产厂家推荐 的方法。 实施例
[0化7]实施例1 材料 1.试剂盒 本发明试剂盒包含W下组分:RT-PCR溶液和OneStep Enzyme Mix (购自德国QIAGEN公 司）。
[005引 RT-PCR溶液包含W下组分：超纯水、OneStep RT-PCR缓冲液，5x (450ml/500)， KG、白蛋白，Rinderserum, Mol-Biol.、100mmol/L dATP、100mmol/L dCTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dTTP、引物组1(正向引物1和反向引物1)、探针1(探针1)、引物组2 (正向 引物2和反向引物2)和探针2(探针2)。
[0化9] 2.定量标准品 用肥V假病毒化CV Armored RNA, SEQ ID NO: 9)制备。首先标定浓度(可溯源至中国 食品药品检定研究院的丙型肝炎病毒RNA国家定量标准品(购自中国食品药品检定研究院， 批号:GB-1307004)，然后用阴性血浆稀释至合适浓度。检测4个定量标准品各3次，计算每一 标准品标示浓度的对数值，W浓度的对数值为Yi，Ct均值为Xi，进行线性拟合并计算线性相 关系数，线性相关系数应I r I值>0.98。
[0060] 3. HCV对照 3.1 HCV阴性对照： 市售阴性化CV-RNA = 0 lU/mL)且外观澄清的血清或血浆。
[0061] 3.2 HCV强阳性对照： 选用HCV假病毒（SEQ ID NO: 9)制备，用市售阴性血清或血浆稀释至合适浓度化(：￥- RNA = 6.32 X 1〇5~6.32 X l〇6lU/mL)。
[0062] 3.3 HCV临界阳性对照： 选用HCV假病毒（SEQ ID NO: 9)制备，用市售阴性血清或血浆稀释至合适浓度化(：￥- RNA = 6.32 X 1〇3~6.32 X l〇4lU/mL)。
[0063] 4.样品制备试剂 样品制备试剂为QIAsym地ony Virus/Bacteria Midi Kit (购自德国QIAGEN，批号 148045667)，其包含下列成分：PK 化nzyme Rack Virus (购自QIAGEN GmbH))、Reagent RackVirus(购自QIAGENGm地，包含MBS、QSL2、QSBl、QSWl、QSW5、QSW2)和AVE(40ml/20ml/ 2ml)。
[0064] 方法 1. HCV RNA样品的制备 按照QIAsymphony SP/AS自动化仪器操作说明书进行操作，利用样品制备试剂 QIAsymphony Virus/Bacteria Midi Kit按照试剂说明书进行核酸自动化提取，并按照下 表用量完成自动化上样。
[00化]表3
2. 巧光定量RT-PCR反应(一步法） 在使用本发明试剂盒进行的巧光定量RT-PCR反应中，使用W下引物和探针： 正向引物 1: ACCCTATCAGGCAGTACCACAAG 反向引物 1: CGTGCCCCCGCAAGA 探针 1: FAM-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCG-BHQ1 正向引物2: GAGTGTCGTGCAGCCTCCAGG 反向引物2: AATTCCGGTGTACTCACCGG 探针 2: FAM-CCACTATGGCTCTCCCGGGAGG-B册 1。
[0066] 反应条件如下：50°C 30分钟，95°C 15分钟，95°C 15秒，50°C 45秒，72°C 15秒，循 环45次。反应体系50μ1，其中引物终浓度0.4μΜ，探针终浓度0. ΙμΜ，dNTP终浓度0.3mM，样品 3化1，酶混合物化1。
[0067] 实施例2 -本发明试剂盒的最低检测限(L0D) 使用实施例1中所述的定量标准品，用阴性血浆稀释至50IU/ml (lU/ml表示每毫升所 含病毒的量）。通过实施例1中所述的方法制备标准品的HCV RNA。使用本发明试剂盒，通过 巧光定量RT-PCR反应对每个浓度梯度重复检测25次。
[006引 AB口300、AB口500、RGQ和LC480四个PCR平台检测原始数据见图1(仅示第1批），结 果统计见下表4。
[0069] 表4
结果表明本发明试剂盒最低检测限可W达到50IU/ml。目前国内几家优秀体外诊断试 剂生产企业HCV试剂盒的灵敏度均较低，为250 lU/ml~1000 lU/ml，本发明试剂盒明显占 优。
[0070] 实施例3 -本发明试剂盒的精密度(重复性） 取1份HCV临床阳性样本，用定量标准品标定浓度后，梯度稀释成5 X 102IU/ml和5 X 104IU/ml浓度的2个样本。通过实施例1中所述的方法制备临床阳性样本的HCV RNA，用3个 批次的本发明试剂盒，通过巧光定量RT-PCR反应对每个样本重复检测40次，统计每个样本 定量结果均值、标准差，并计算变异系数CV。
[0071] 通过W下标准判定精密度：W同一浓度样品的定量检测结果的对数值计算变异系 数(CV，％)(CV = STD/平均值xlOO%，即分别计算定量检测结果对数值的标准偏差和平均值， 然后用标准偏差除W平均值得到变异系数），同一批次试剂盒的检测结果用于计算批内精 密度。要求CV小于5%。
[0072] 结果见下表5。
[0073] 表 5
3批试剂盒检测了5 X 102IU/ml和5 X 104IU/ml两个浓度样本，定量结果变异系数CV< 5%，显示试剂盒精密度较好。
[0074]实施例4 -本发明试剂盒的定量准确性和线性 取定量标准品，用阴性血浆梯度稀释至l〇6IU/ml、105IU/ml、104IU/ml、10 3IU/ml和 102IU/ml浓度。通过实施例1中所述的方法制备定量标准品的HCV RNA，用本发明试剂盒通 过巧光定量RT-PCR反应对每个浓度重复检测3次。结果见下表6。
[00巧]表6
各样本定量检测浓度均在验收标准范围（样本实际浓度± ο. 51ogl0值范围）内，提示试 剂盒定量检测准确性好。
[0076] 各浓度样本理论浓度loglO对数值与PCR Ct值之间呈现良好的线性关系，线性拟 合的相关系数大于0.99 (见图2)。试剂盒检测线性范围为1X102~5X107 lU/mL。
[0077] 实施例5 -本发明试剂盒的特异性 按照实施例1，用本发明的试剂盒检测了HCV核酸国家参考品（购自中国食品药品检定 研究院，批号:GB-1307004)中的特异性参考品、皿V、HIV-1、邸V、HSV-1、HSV-2、CMV、金黄色 葡萄球菌样本W及健康献血员血浆样本，检测结果均显示肥V RNA=0 lU/ml(结果未显示）。 运表明本发明试剂盒无交叉反应，特异性较好。
[007引实施例6 -本发明试剂盒的敏感性 按照实施例1，用本发明的试剂盒检测了HCV核酸国家参考品（购自中国食品药品检定 研究院，批号:GB-1307004)中的阳性参考品和NIBSC的用于核酸扩增技术的HCV RNA基因型 组(购自NIBSC，code:08/264) 1、2、3、4、5和6基因型样本，所有样本检测结果为肥V RNA〉0 IU/ mL(结果未显示），即HCV1-6基因型样本均能被本发明试剂盒成功检测，显示试剂盒具 有良好的敏感性。
[0079]本领域技术人员应该明白，本文所述发明除明确阐述的内容外，还容允变化和修 改，特别是等同的变化和修改。应该理解，所有运样的变化和修改均落入本发明，特别是权 利要求中所限定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种用于检测人丙型肝炎病毒HCV基因的引物组，所述引物组包括至少一种选自以 下的引物组： (1) 引物组1，其包含具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物;和 (2) 引物组2,其包含具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的引物。2. -种用于检测人HCV基因的探针，所述探针包括至少一种选自以下的探针： (1) 探针1，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列;和 (2) 探针2,其具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 优选其中所述探针通过标记物来标记。3. 权利要求2的探针，其中所述探针的一个末端例如5'末端通过报告荧光基团标记，并 且探针的另一个末端例如3'末端通过淬灭荧光基团标记。4. 权利要求3的探针，其中所述报告荧光基团为FAM，并且所述淬灭荧光基团为MGB或 BHQ1或BHQ2。5. -种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其包含权利要求1的引物组，或权利要 求2-4中任一项的探针。6. -种用于检测人HCV基因的试剂盒或微阵列，其包含权利要求1的引物组，和权利要 求2-4中任一项的探针。7. 权利要求1的引物组在制备用于检测样品中HCV基因的试剂盒或微阵列中的用途。8. 权利要求1的引物组和权利要求2-4中任一项的探针在制备用于检测样品中HCV基因 的试剂盒或微阵列中的用途。9. 权利要求7或8的用途，其中所述样品选自生物学样品、环境样品和工业样品，优选其 中所述样品为体液样品或组织样品，和更优选所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、 分泌液和泪液。10. 检测样品中HCV基因的方法，所述方法包括： (1) 提取和任选纯化样品中的核酸，和 (2) 使用权利要求1的引物组进行扩增和/或使用权利要求2-4中任一项的探针进行特 异性杂交，以检测所述核酸， 其中所述方法不用于诊断受试者受到HCV感染， 优选其中所述核酸为RNA，并且 优选所述检测是RT-PCR检测，更优选荧光定量RT-PCR检测。
【文档编号】C12Q1/70GK106011309SQ201610341409
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】陈华, 彭进
【申请人】凯杰生物工程（深圳）有限公司