通过引物延伸合成探针库的制作方法
【专利说明】通过引物延伸合成探针库
[0001]
[0002]长期以来，已将染色体重排、缺失和其它畸变与遗传疾病相关。染色体结构异常通常起因于同源重组中的错误。结构异常可出现在配子中并因此将存在于受影响个体的所有细胞中，或者它们可在有丝分裂期间出现并产生具有一些正常细胞和一些异常细胞的遗传嵌合个体。
[0003]持续需要开发有效的方法以制造用于基因组学，特别是用于染色体异常的检测和分析的探针。
[0004]概沭
[0005]本文提供通过引物延伸产生探针库的方法。在某些实施方式中，所述方法包括:使包含具有下式VfB-3’的顶链(top strand)序列的第一寡核苷酸的群体与包含具有下式V2’ -B’ -3’的底链(bottom strand)序列的第二寡核苷酸的群体杂交以提供双链体的群体。在这些实施方式中，B和B’的核苷酸序列互补且它们的长度为至少15个核苷酸；第一群体的每种寡核苷酸的B的核苷酸序列相同；第二群体的每种寡核苷酸的B’的核苷酸序列相同A的核苷酸序列在第一群体的寡核苷酸之间是可变的；V2’的核苷酸序列在第二群体的寡核苷酸之间是可变的；且1和￥2’与参考基因组中的不同位点杂交。杂交之后，使双链体中寡核苷酸的3’末端延伸以产生双链产物的群体，所述双链产物包含具有下SV1-B-V2的顶链序列，其中VgV 2’互补。
附图简介
[0006]本领域技术人员将理解，下述附图仅用于阐释目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
[0007]图1示意性阐释了本方法的一个实施方式的一些一般原理。
[0008]图2示意性阐释了本方法的一个实施方式的另一些原理。
[0009]图3示意性阐释了可如何应用本方法来制造单链探针。
[0010]图4示意性阐释了通过本方法产生的单链产物的一些特征。
[0011]图5示意性阐释了晕环(halo)探针的两种类型。
[0012]图6示意性阐释了可如何将本方法的产物用于基因组分析。
[0013]图7显示了可如何通过引物延伸来制造晕环探针。
[0014]图8显示了可如何扩展图7中所示的一般原理以制造多个晕环探针。
[0015]定义
[0016]在更详细描述示例性实施方式之前，给出下列定义以阐释和定义说明书中所用术语的含义和范围。
[0017]数值范围包括限定该范围的数值。除非另有说明，分别地，核酸是以5’到3’方向从左往右书写，氨基酸序列是以氨基到羧基方向从左往右书写。
[0018]除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton,等人，DICT1NARY OF MICROB1LOGY ANDMOLECULAR B1LOGY,第2版，John Wiley and Sons, New York(1994),和Hale&Markham, THEHARPER COLLINS DICT1NARY OF B1LOGY, Harper Perennial, N.Y.(1991)向技术人员提供了许多本文所用术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和容易参考，下文对某些术语进行定义。
[0019]必须注意:当在本文和所附权利要求中使用时，除非上下文明确指出相反情况，否则不使用数量词时涵盖复数的指代物。例如，术语“引物”指一个/种或多个/种引物，即单个/种引物和多个/种引物。还应注意:权利要求可撰写成排除任何任选元素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的引述相联系的这些排他性术语如“仅仅”、“仅”等或使用“否定性”限制的在先基础。
[0020]术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基还含有已被修饰的其它杂环碱基的部分(moiety)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其它杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记以及可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖，也可以包含其它糖的部分。经修饰的核苷或核苷酸也包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。
[0021]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，其用于描述任意长度的由核苷酸例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的聚合物，例如，多于约2个碱基，多于约10个碱基，多于约100个碱基，多于约500个碱基，多于1000个碱基，高达约10000个或更多碱基，并可酶促地或合成地生产(例如，如美国专利号5，948，902和其中所引用的参考文献中所述的PNA)，其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖骨架，但PNA的骨架由通过肽键相连的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元构成。在PNA中，多种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。锁核酸(LNA)(通常被称为无法接近的RNA)是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。所述桥将核糖“封锁”为3’ -内(北(North))构象，这通常发现于A-型双链体(duplex)中。只要期望，可将LNA核苷酸与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是含有相互之间结合的稳定性较低的非天然核苷酸的核酸。例如，非结构化核酸可含有G’残基和C’残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在形式(即类似物)，它们稳定性较低地相互碱基配对，但保留分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。US20050233340中描述了非结构化核酸，其中关于UNA的公开内容通过引用被并入本文。
[0022]本文所使用的术语“寡核苷酸”表示长度为约2-200个核苷酸，直至500个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可通过酶法制成，在一些实施方式中，其长度为30-150个核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、61-70,71-80,80-100,100-150或150-200个核苷酸。在某些情况下，可如下制得寡核苷酸的群体:利用原位合成方法制造寡核苷酸阵列，以及从基底切割寡核苷酸。所述方法的实例描述于例如 Cleary 等人(Nature Methods 20041:241-248)和 LeProust 等人(NucleicAcids Research 201038:2522-2540)中。
[0023]本文所使用的术语“引物”指在纯化的限制消化物中天然存在的或者通过合成产生的寡核苷酸，当被放置在与核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)且处于合适的温度和pH时，其能够担当合成起始点。引物可以是单链的或双链的，但必须足够长以在诱导剂存在时启动期望延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物典型地含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可含有更少核苷酸。本文的引物被选择为与特定靶DNA序列的不同链基本上互补。这意味着:引物必需足够互补以与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可被连接到引物的5’末端，而引物序列的其余部分与链互补。或者，非互补碱基或更长序列可散布在引物中，条件是:引物序列与链序列足够互补以与其杂交并从而形成合成延伸产物的模板。
[0024]术语“杂交”指的是下述过程，其中核酸链在正常杂交条件下与第二互补核酸链退火并形成稳定双链体(同双链体或异双链体)，且在相同的正常杂交条件下不与无关的核酸分子形成稳定双链体。在杂交反应中，通过使两条互补的核酸链退火来实现双链体的形成。可通过调节杂交反应发生的杂交条件(通常被称为杂交严格性)使杂交反应高度特异，从而，除非两条核酸链含有基本上或完全互补的一定数目的特定序列核苷酸，否则两条核酸链之间的杂交将不形成稳定双链体，例如在正常严格性条件下保留双链性(double-strandedness)区域的双链体。对于任何给出的杂交反应，“正常杂交或正常严格性条件”易于确定。参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in MolecularB1logy, John ffiley&Sons, Inc., New York，或 Sambrook 等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press。本文使用的术语“杂交”指的是任何下述过程，通过所述过程核酸链通过碱基配对与互补链结合。
[0025]如果核酸与参考核酸序列在中度至高度严格性杂交和洗涤条件下特异性相互杂交，那么认为这两种序列“选择性可杂交”。中度和高度严格性杂交条件是已知的(参见，例如，Ausubel,等人，Short Protocols in Molecular B1logy,第 3 版，Wiley&Sons 1995和 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，2001Cold SpringHarbor, N.Y.) 0高度严格性条件的一个实例包括在约42C下在50 %甲酰胺、5X SSC、5XDenhardt氏溶液、0.5% SDS和100 μ g/mL变性运载体DNA中杂交，随后在室温下在2X SSC和0.5% SDS中洗涤2次并在42°C下在0.1X SSC和0.5% SDS中额外洗涤2次。
[0026]本文所使用的术语“互补”表示两种核酸(例如，DNA或RNA)含有能够形成匹配的沃森-克里克碱基对从而产生双链区(除了在错配区)的一系列连续核苷酸。因此，一条核酸链中的腺嘌呤与相对的互补DNA链中的胸腺嘧啶或相对的互补RNA链中的尿嘧啶配对，一条核酸链中的鸟嘌呤与相对的核酸链中的胞嘧啶配对。配对区域被称为“双链体”。或者，如果两种核酸分子能够足够稳定地相互杂交以允许它们在至少常规“低严格性”条件下保持相互退火，则它们被称为“互补”。因此，两种互补的分子不需要展示出精确的互补性，而仅需序列足够互补以能形成稳定双链结构。因此，偏离完全互补性是可以允许的，只要这种