一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒，采用Taqman探针实时荧光PCR法，分别针对16S rDNA、vanA、vanB核酸保守区设计引物和荧光标记探针，3个基因探针5’端均标记荧光报告基团FAM，3’端均标记荧光淬灭基团TAMRA。引物、探针配成PCR检测混合液后，加入酶与样本核酸，选用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光信号的变化实现目的基因的检测。本试剂盒具有准确率高、特异性强、灵敏度高的特点，能够对尿液样本中的肠球菌和VRE进行快速、准确检测。
【专利说明】
一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引 物、探针、方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus spp.，VRE)能引起尿 路、腹腔、盆腔、外科手术感染及心内膜炎、脑膜炎等疾病，病死率达到21.0%~27.5%，是 全球范围内主要的医院条件致病菌。其中，对人类致病的主要为奠肠球菌(Enterococcus faecal is)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)，最常见的耐药基因型为vanA和vanB。肠球 菌作为常见院内感染多重耐药菌，对头孢菌素类、部分氟喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗菌 药物天然耐药。耐万古霉素肠球菌能将其耐药基因转移到其它病原微生物。因此，对人类构 成严重威胁的不仅是VRE本身，还包括其耐药基因转移所产生的一些难以治疗的新耐药菌 株。因此，加强VRE检测不仅有利于指导临床用药，而且有利于VRE抗性转移的检测和控制。
[0003] 目前临床上VRE主要通过细菌培养鉴定加药敏试验的方法检测，这种检测方法不 仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差，传统方法难以区分不同的基因型，而且无法 了解抗性引起的分子生物学机制。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物、探针、方法及试剂盒，解决现 有技术中VRE的检测不仅操作繁琐、费时费力、灵敏度较低，重复性差，传统方法难以区分不 同的基因型，而且无法了解抗性引起的分子生物学机制的技术问题。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，检测肠球菌基因 16S rDNA的引物 核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，检测肠球菌基因 16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如 SEQIDN0:4所示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~ 7所不，检测耐万古霉素肠球囷特异性基因 vanA的Taqman探针的核甘酸序列如SEQIDN0:8所 示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，检 测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0007] -种检测耐万古霉素肠球菌基因的方法，包括：
[0008] 样本核酸制备，以获得核酸模板；
[0009] 分别针对肠球菌基因16S rDNA、耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA、耐万古霉素 肠球菌特异性基因 vanB设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测肠球菌基因16S rDNA 的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸 序列如SEQIDN0: 4所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如 SEQIDN0:6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的Taqman探针的核苷酸序列如 SEQIDN0:8所示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10 ~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO: 12所示；
[0010]取尿液样本、阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混 匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
[0011 ] 配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿啼啶-N-糖基化酶 (UNG酶)混合组成；
[0012] 将16S rDNA基因 PCR检测混合液与酶试剂震荡混勾，进行离心处理；将vanA基因 PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理;将vanB基因 PCR检测混合液与酶试剂震 荡混匀，进行离心处理
[0013] 分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、 阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光 PCR管中，进行荧光PCR扩增，反应条件为:37°C X 2min，94°C X 2min，循环1次;93°C X 15s，60 °C X 60s，循环40次;单点荧光检测在60°C，并在此采集荧光信号。
[0014] 对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过 荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
[0015] -种检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，包括核酸抽提液、第一引物探针混合 液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性对照品和 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱氧核糖核 苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成;所述第二引物 探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针 组成;所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB基因的上、下游引物 及一条荧光标记探针组成；
[0016] 其中，检测肠球菌基因 16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0: 2~3所示，检测肠 球菌基因 16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;检测耐万古霉素肠球菌 特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基 因 vanA的Taqman探针的核甘酸序列如SEQIDN0:8所不;检测耐万古霉素肠球囷特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的 Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0017]本发明的有益效果为:具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率99 % 以上;特异性强，与尿液中常见致病菌大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿 假单胞菌、变形杆菌、奇异变形杆菌、血链球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、产酸克雷伯菌、 洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、白喉杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟 菌均无交叉反应;灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为10 3copies/mL，按照菌培 养法确定的最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人尿液样本中肠球菌基因 16S rDNA和耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA和vanB，为临床确定肠球菌和VRE感染提供 辅助诊断方法，为临床医生用药提供参考。
【附图说明】
[0018]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获 得其他的附图。
[0019] 图1为本发明实施例四的肠球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图；
[0020] 图2为本发明实施例四的vanA型VRE感染样本的荧光定量PCR曲线图；
[0021 ]图3为本发明实施例四的vanB型VRE感染样本的荧光定量PCR曲线图。
【具体实施方式】
[0022]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0023] 实施例一
[0024]本发明实施例提供了一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，检测肠球菌 基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman 探针的核昔酸序列如SEQIDN0:4所不;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的引物核昔 酸序列如SEQIDN0:6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的Taqman探针的核苷 酸序列如SEQIDN0:8所示；检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如 SEQIDN0:10~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的Taqman探针的核苷酸序列 如 SEQIDN0:12所示；
[0025]其中，16S rDNA基因设计的特异性引物的序列如下：
[0026] 上游引物P-16S rDNA-F:5'-CGCTAGACCGCGAGGTCAT-3'
[0027] 下游引物P-16S rDNA-R:5'-ACTAGCGATTCCGGCTTCAT-3'
[0028] 针对16S rDNA基因的TaqMan荧光标记探针序列如下：
[0029] T-16SrDNA:5 '-FAM-CAAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCG-TAMRA-3 '
[0030] 针对vanA基因设计的特异性引物的序列如下：
[0031 ]上游引物 P-VanA-F: 5 ' -AGTGCCGCGTTAGCTGTTG-3 '
[0032] 下游引物P-VanA-R: 5 ' -GCGTTTTCAGAGCCTTTTTCC-3 '
[0033] 针对vanA基因的TaqMan焚光标记探针序列如下：
[0034] T-vanA:5 '-FAM-ATCAGGCTGCAGTACGGAATCTTTCGTA-TAMRA-3 '
[0035] vanB基因设计的特异性引物的序列如下：
[0036] 上游引物 P-VanB-F: 5 ' -CGTTTAGTTCTTCCGTACT-3 '
[0037] 下游引物P-VanB-R: 5 ' -GAGGACGCTTACCTACCCT-3 '
[0038] 针对vanB基因的TaqMan焚光标记探针序列如下：
[0039] T-vanB:5 '-FAM-TTACGCCAAAGGACGAACCTGACCGT-TAMRA-3 '
[0040] 16S rDNA、vanA、vanB基因探针的核苷酸序列5 '端均标记的荧光报告基团为FAM， 3 '端均标记的淬灭基团为TAMRA。
[0041 ] 实施例二
[0042] 本发明实施例中又提供了一种检测耐万古霉素肠球菌基因的方法，包括：
[0043] 步骤101、样本核酸制备，以获得核酸模板；
[0044] 步骤102、分别针对肠球菌基因16S rDNA、耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA、耐 万古霉素肠球菌特异性基因 vanB设计特异性引物和荧光标记探针；
[0045] 其中，检测肠球菌基因 16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，检测肠 球菌基因 16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;检测耐万古霉素肠球菌 特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基 因 vanA的Taqman探针的核甘酸序列如SEQIDN0:8所不;检测耐万古霉素肠球囷特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的 Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；
[0046] 步骤103、取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混 匀，并进行加热和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测；
[0047] 步骤104、配置酶试剂；
[0048] 其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合 组成；
[0049] 步骤105、将16S rDNA基因 PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理；将 vanA基因 PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理;将vanB基因 PCR检测混合液与 酶试剂震荡混匀，进行离心处理；
[0050]步骤106、分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提 上清液、阴性对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液 的荧光PCR管中，进行荧光PCR扩增；
[0051 ]其中，反应条件为：37°C X 2min，94°C X 2min，循环 1 次；93 °C X 15s，60°C X 60s，循 环40次;单点荧光检测在60°C，并在此采集荧光信号；
[0052] 步骤107、对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩 增，通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
[0053] 其中，检测结果根据Ct值进行判定，仪器Ct栏显示Undet. (ABI StepOnePlus)或不 显示Ct值(Eppendorf Mastercycler ep realplex焚光定量PCR检测系统），表示检测样品 低于检测限，报告为阴性;待检样品CT<35,检测结果报告为阳性;待检样品C T显示在35~40 之间，需重复测定，CT显示仍在35~40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性;若扩增结果 为一直线，则判断为阴性。
[0054] 本发明采用Taqman探针实时荧光PCR法，在同源性比对肠球菌属16S rDNA、耐万古 霉素 vanA和vanB基因序列的基础上，选取保守片段分别设计针对这3个基因的特异性引物 和特异性的荧光标记探针。探针5'端标记FAM荧光素为荧光报告基团（用R表示），3'端标记 TAMRA荧光素为荧光淬灭基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5 '端荧光报告基团发出的荧 光信号。PCR反应进入退火阶段时，探针先与模板上的目的基因结合，随后引物与目的基因 结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团吸收，仪器检测不到荧光信号；当反应进行 到延伸阶段时，Taq DNA聚合酶的5'-3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基 团游离出来，所发出的的荧光信号没被Q基团吸收，检测器能检测到荧光信号。随着PCR反应 的进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。通过荧光信号增长曲线，实现目的基因 的检测。
[0055] 实施例三
[0056]本发明实施例提供了一种检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，包括核酸抽提 液、第一引物探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性 对照品、阳性对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针 混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针 组成;所述第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物 及一条荧光标记探针组成;所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB 基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成；
[0057] 其中，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，检测肠 球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;检测耐万古霉素肠球菌 特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基 因 vanA的Taqman探针的核甘酸序列如SEQIDN0:8所不;检测耐万古霉素肠球囷特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的 Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0058] 所述核酸抽提液由3%(M/V)Chelex-100、0.5%(V/V)Tris-HCl，lM，pH9.0 和0.5% (V/V)TritonX-100 组成。
[0059] 所述第一引物探针混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、2.4yL ΙΟμ mol/L引物、0.4yL ΙΟμ mol/L探针和 18.2yL灭菌纯化水组 成；第二引物探针混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN (U)TP、1.2yL ΙΟμ mol/L引物、0.2yL ΙΟμ mol/L探针和20.9yL灭菌纯化水组成;第三引物探 针混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、1.2yL ΙΟμ mol/L引物、0.6yL ΙΟμ mol/L探针和20.4yL灭菌纯化水组成。
[0060] PCR反应酶系由5U/yL Taq DNA聚合酶和2U/yL UNG酶按体积比3:1比例混合组成。
[0061] PCR扩增的条件为：37°C X2min，94°C X2min，循环 1 次；93°C X 15s，60°C X60s，循 环40次;单点荧光检测在60°C，对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM 通道进行扩增。
[0062] 所述阳性对照品为含有灭活的E-16S rDNA菌、E-vanA菌和E-vanB菌的混合液，菌 浓度为106CFU/mL;阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度为106CFU/mL，其中，E-16S rDNA菌为含有16S rDNA基因片段的工程菌，E-vanA菌为含有vanA基因片段的工程菌， E-vanB菌为含有vanB基因片段的工程菌。
[0063]本试剂盒具有准确率高，临床试验结果与DNA测序结果总符合率99%以上;特异性 强，与尿液中常见致病菌大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变 形杆菌、奇异变形杆菌、血链球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、产酸克雷伯菌、洋葱伯克霍 尔德菌、鲍曼不动杆菌、白喉杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌均无交叉 反应;灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为1 〇3cop i e s/mL，按照菌培养法确定的 最低检测限为103CFU/mL。本产品用于体外定性检测人尿液样本中肠球菌基因16S rDNA和 耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA和vanB，为临床确定肠球菌和VRE感染提供辅助诊断方 法，为临床医生用药提供参考。
[0064] 实施例四
[0065]本实施例结合具体检测案例说明本发明的具体应用方式，首先收集临床样本，经 细菌培养鉴定与药敏试验法结合DNA测序确定为肠球菌感染、vanA型VRE感染、vanB型VRE感 染及VRE阴性样本各3例，采用本试剂盒进行检测，统计结果符合率。
[0066] 1、样本核酸制备
[0067] 尿液:取样本3mL，12，OOOrpm 2min;弃上清，沉淀中直接加入50yL核酸抽提液，充 分混勾，98°C lOmin(误差不超过lminhl^jOOrpm 5min，取上清5μΙ^ι^ΡΟ?反应。
[0068] 2、对照品准备
[0069] 取阳性对照品、阴性对照品各100yL分别置于1.5mL(或0.5mL)离心管中（冻存试剂 融解后震荡混匀10 S)，分别加入核酸抽提液5 OyL充分混匀，9 8 °C 1 Om i η，然后12，0 0 Or pm 5min，取上清5yL做PCR反应。
[0070] 3、酶试剂配制
[0071] 分别取nX35yL肠球菌16S核糖体DNA(16S rDNA)PCR检测混合液，耐万古霉素肠球 菌A基因（vanA) PCR检测混合液，耐万古霉素肠球菌B基因（vanB) PCR检测混合液与η X 0.4yL 酶(Taq+UNG)混合，震荡混匀数秒，3000rpm离心混匀数秒。
[0072] 4、加样
[0073]分别取上述混合液35yL置于PCR管中，然后将阴性对照品、样本和阳性对照品的处 理上清液各5yL分别加入各个已有混合液的PCR管中，盖好管盖，立即进行荧光PCR扩增反 应。
[0074] 5、PCR 扩增
[0075] 反应管置于荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
[0076] 37°C X2min，94°C X2min，循环 1 次；93°C X15sec，60°C X60s，循环40次；单点荧光 检测在60°C，反应体系为40yL。
[0077] 荧光通道检测选择:选用FAM通道。
[0078] 6、结果判定
[0079] 检测结束后，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超 过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。仪器C T栏显示Undet.(ABI StepOnePlus)或不显示CT 值(Eppendorf Mastercycler ep realplex)焚光定量PCR检测系统），表示检测样品低于检 测限，报告为阴性;待检样品CT<35,检测结果报告为阳性;待检样品C T显示在35~40之间， 需重复测定，CT显示仍在35~40之间，且扩增曲线呈S型，则判断为阳性;若扩增结果为一直 线，则判断为阴性。
[0080] 7、检测结果检验
[0081]本发明的检测结果与细菌培养鉴定与药敏试验结果一致，荧光PCR检测结果如图 1-3所示，图1为肠球菌感染样本的荧光定量PCR曲线图，可见随着PCR反应的进行，16S rDNA 基因对应的PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系，可判断16S rDNA基因为阳性，vanB基 因和vanA基因为阴性。图2为vanA型VRE感染样本的荧光定量PCR曲线图，可判断16S rDNA基 因和vanA基因均为阳性。图3为vanB型VRE感染样本的荧光定量PCR曲线图，可判断16S rDNA 基因和vanB基因均为阳性。
[0082]以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方 式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对 于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变 之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1. 一种检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，其特征在于，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核 苷酸序列如SEQIDNO: 4所示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如 SEQIDNO: 6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的Taqman探针的核苷酸序列如 SEQIDN0:8所示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10 ~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 VanB的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0: 12所示。2. 根据权利要求1所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的引物和探针，其特征在于，16S rDNA、vanA、vanB基因探针的核苷酸序列5 '端均标记的荧光报告基团为FAM，3 '端均标记的 淬灭基团为TAMRA。3. -种检测耐万古霉素肠球菌基因的方法，其特征在于，包括： 样本核酸制备，以获得核酸模板； 分别针对肠球菌基因16S rDNA、耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA、耐万古霉素肠球 菌特异性基因 vanB设计特异性引物和荧光标记探针，其中，检测肠球菌基因16S rDNA的引 物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，检测肠球菌基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列 如SEQIDNO: 4所示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 6 ~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO: 8 所示;检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示， 检测耐万古霉素肠球囷特异性基因 vanB的Taqman探针的核甘酸序列如SEQIDNO: 12所不； 取阳性对照品、阴性对照品置于离心管中，分别加入核酸抽提液充分混匀，并进行加热 和离心处理，取上清液用于荧光PCR检测； 配置酶试剂，其中，所述酶由水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG 酶)混合组成； 将16S rDNA基因 PCR检测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理;将vanA基因 PCR检 测混合液与酶试剂震荡混匀，进行离心处理;将vanB基因 PCR检测混合液与酶试剂震荡混 匀，进行离心处理； 分别取加酶混匀后的PCR检测混合液置于荧光PCR管中，取样本核酸抽提上清液、阴性 对照品核酸抽提上清液、阳性对照品核酸抽提上清液加入已有PCR检测混合液的荧光PCR管 中，进行荧光PCR扩增，反应条件为：37 °C X 2min，94°C X 2min，循环1次;93 °C X 15s，60 °C X 60s，循环40次;单点荧光检测在60 °C，并在此采集荧光信号； 对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增，通过荧光 定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。4. 一种检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物 探针混合液、第二引物探针混合液、第三引物探针混合液、PCR反应酶系、阴性对照品、阳性 对照品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中，所述第一引物探针混合液由脱 氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一条荧光标记探针组成;所述 第二引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物及一条荧光 标记探针组成;所述第三引物探针混合液由脱氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB基因的上、 下游引物及一条荧光标记探针组成； 其中，检测肠球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示，检测肠球菌 基因16S rDNA的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;检测耐万古霉素肠球菌特异 性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanA的Taqman探针的核甘酸序列如SEQIDNO: 8所不；检测耐万古霉素肠球囷特异性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示，检测耐万古霉素肠球菌特异性基因 vanB的 Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。5. 根据权利要求4所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，所述核酸 抽提液由 3%(M/V)Chelex-100、0.5%(V/V)Tris-HCl，lM，pH9.(^P0.5%(V/V)TritonX-100 组成。6. 根据权利要求4所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，所述第一 引物探针混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、 2.4yL ΙΟμ mol/L引物、0.4yL ΙΟμ mol/L探针和18.2yL灭菌纯化水组成；第二引物探针混合 液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、1.2yL ΙΟμ mol/ L引物、0.2yL ΙΟμ mol/L探针和20.9yL灭菌纯化水组成；第三引物探针混合液由4yL 10X PCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、1.2yL lOymol/L引物、0.6yL ΙΟμ mol/L探针和20.4yL灭菌纯化水组成。7. 根据权利要求4所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，PCR反应 酶系由5U/yL水生栖热菌DNA聚合酶(Taq酶)和2U/yL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按体积比3 :1比例混合组成。8. 根据权利要求4所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，PCR扩增 的条件为：371€\2111丨11，94 1€\2111丨11，循环1次；931€\158,601€\608，循环40次 ；单点荧光 检测在60°C，对于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用荧光PCR仪上的FAM通道进行扩增。9. 根据权利要求4所述的检测耐万古霉素肠球菌基因的试剂盒，其特征在于，所述阳性 对照品为含有灭活的E-16S rDNA菌、E-vanA菌和E-vanB菌的混合液，菌浓度为IO6CFlVmL; 阴性对照品为含有灭活的大肠杆菌溶液，菌浓度为10 6CFU/mL，其中，E-16S rDNA菌为含有 16S rDNA基因片段的工程菌，E-vanA菌为含有vanA基因片段的工程菌，E-vanB菌为含有 vanB基因片段的工程菌。
【文档编号】C12Q1/04GK105950773SQ201610539448
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】王伟建, 倪剑锋, 包婷婷, 翁毅
【申请人】宁波基内生物技术有限公司, 王伟建