一种快速检测八角和红毒茴成分的方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，尤其涉及一种使用实时荧光PCR法检测八角和红毒茴成分的引物和探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，可用于八角和红毒茴成分的快速检测。
【专利说明】
一种快速检测八角和红毒茴成分的方法
技术领域：
[0001] 本发明属生物检测技术领域，涉及八角和红毒茴成分的检测方法，具体涉及检测 八角和红毒茴成分的引物、探针以及检测方法。
【背景技术】
[0002] 八角，又名八角茴香，为木兰科植物八角茴香（Illicium verum)的干燥成熟果实。 秋、冬二季果实由绿变黄时采摘，置沸水中略烫后干燥或直接干燥。八角是著名的调味香 料，味香甜，多为八瓣，顶端呈较钝的鸟喙状;果皮较厚，有较浓郁的香气;果柄较长，弯曲。 也供药用，有祛风理气、和胃调中的功能，用于中寒呕逆、腹部冷痛、胃部胀闷等，但多食会 损目发疮。果皮、种子、叶都含芳香油，称八角茴香油（简称茴油）是制造化妆品、甜香酒、啤 酒和食品工业的重要原料。八角和茴油除国内需用外，又是重要的出口物资，我国八角占世 界市场的80%以上。
[0003] 红毒茴，又名莽草，外形与八角相似，果实多为8-13瓣，顶端呈较尖的鸟喙状，向后 弯曲；果皮较薄，味略苦;果柄较短，平直或微弯。果和叶有强烈香气，可提芳香油，为高级香 料的原料。红毒茴果含莽草亭，有剧毒，不能作食用香料，过去有的地区曾将果作八角茵香 用，发生严重中毒。本种根、根皮也有毒，民间用作祛风除湿，散疲止痛，治跌打，风湿等，根 用量一般不超过一钱，根皮只用二分。
[0004] 因八角和红毒茴外形相似，而八角每公斤的价格是红毒茴的3倍左右，于是一些生 产厂家和商贩经常将红毒茴掺在八角中进行出售。一般来说，八角和红毒茴可以通过外观 进行区分，但是一些商贩为防顾客鉴别，通常将其多出的角掰掉或弄碎，或者磨成粉末代替 八角加工为五香粉等复合调味料中，使之无法分辨。因红毒茴有剧毒，作为调料使用会引起 中毒，轻者恶心呕吐，严重者烦躁不安，瞳孔散大，血压下降，甚至危及生命安全。
[0005] 周晶等（八角茴香与其伪品莽草的红外光谱三级鉴定研究，光谱学与光谱分析， 2008,第28卷，第12期，2864-2867)使用红外光谱三级鉴定的办法对八角和红毒茴进行了区 分，因为八角和红毒茴的几个特征峰比较接近，而且方法需要依次采用一维红外光谱、二阶 导数谱和二维相关红外光谱，通过逐渐提高分辨率使谱图的差别增大方才可对八角和红毒 茴进行区分，分析方法较为复杂。
[0006] 实时荧光PCR-TaqMAN探针法可从基因水平进行物种鉴定，具体是在PCR扩增反应 体系中添加一个特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，即检测靶核 苷酸序列扩增状态，以进行结果判定。它的主要优点是：
[0007] (1)在闭管状态下进行扩增产物检测，无需PCR产物的后处理，避免了扩增产物污 染而致的假阳性，保证了结果的可靠性；
[0008] (2)探针杂交特异性更强，灵敏性更高，在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以 与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，荧光信号由仪器自动收集，进一步提高了灵敏 度；
[0009] (3)无需酶切位点存在，无需进行酶切，电泳，节省了时间，PCR后无需后续处理；
[0010] (4)整个实验耗时短，操作简单快速，数据分析较建安。。
[0011] 目前，对于八角和易掺假且有毒性的红毒茴还没有实时荧光PCR检测方法，本领域 迫切需要开发这种快速简便的检测八角和红毒茴成分的技术。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供了一种使用实时 荧光PCR法检测八角和红毒茴成分的引物和探针及检测方法。
[0013] 根据八角的微卫星序列（microsatellite sequence)和红毒茴的ITS2基因 (Internal Transcribed Spacer 2)设计特异检测引物和探针。
[0014]实时荧光PCR检测八角成分的引物为：
[0015] 上游引物PI :GGGTTGGTAGGTTCATAA
[0016] 下游引物P2 :GCACTCACACTTATATGTATA
[0017] 检测八角成分的荧光探针序列为:CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA
[0018] 上述荧光探针，5 '端为FAM标记，3 '端为TAMRA标记
[0019] 实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为：
[0020] 上游引物PI :CTCCCCCCTCCCTTGATC
[0021] 下游引物P2: CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG
[0022] 检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA
[0023] 上述荧光染料，5 '端为VIC标记，3 '端为MGB标记。
[0024] 实时荧光PCR检测八角和红毒茴成分的方法，其步骤如下：
[0025] 1、提取待检样品基因组DNA
[0026] 2、将检测八角和红毒茴成分的上游引物、下游引物和探针分别稀释至ΙΟμ mol/L， 然后等体积合并为混合引物(探针），以所提取的DNA作为模板，加入上述引物对和荧光染料 标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值；
[0027]所述的实时荧光PCR反应体系为： 2xReal-time PCR 预混液 10μ1 上游混合引物（ΙΟμιτιοΙ/L) ΙμL 下游混合引物（ΙΟμιτιοΙ/L) ΙμL
[0028] 混合探针（ΙΟμιτιοΙ/L) ΙμL 样品 DNA (1 ~lOOng/μΙ) 2μ1 ddH2〇 5μ1
[0029] 3、所述的实时荧光PCR反应条件为95°C 10min，l个循环；95°C 15s，58°C 30s，40 个循环，在每次循环的58°C 30s时收集荧光，设立FAM和VIC通道。
[0030] 所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为：
[0031] 空白对照：以ddH20为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC 通道检测Ct值大于或等于40;
[0032]阴性对照：以非八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧 光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
[0033]阳性对照：以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时 荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36;
[0034]待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照，阳性对照和空白 对照结果正常者，判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分；
[0035] 待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照，阳性对照和空白 对照结果正常者，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分；
[0036] 待测样品FAM和（或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次 扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出八 角和(或）红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结 果正常，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
[0037] 本发明提供了一种使用实时荧光PCR法检测八角和红毒茴成分的引物和探针及具 体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，可用于八角和红毒茴成分的快速检测。
【附图说明】
[0038] 图1是本发明实施例1检测八角和红毒茴成分阳性样品的荧光PCR扩增图；其中，1 为八角;2为红毒茴；
[0039] 图2是本发明实施例2检测八角、红毒茴、地楓皮、大八角样品的荧光PCR扩增图；其 中，1为八角;2为红毒茴;3为地楓皮;4为大八角。
【具体实施方式】：
[0040] 下面对本发明做进一步详细说明。
[0041 ] 实施例1
[0042] 1.所用引物和探针：
[0043] 利用GenBank数据库（https : //www .ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找八角 (Iphigenia indica)和红毒茴(Fritillaria maximowiczii)的特异序列，分别确定使用微 卫星序列和ITS2基因，其GenBank Accession登录号分别为KC176699.1和KF022354.1，设计 并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。
[0044] 实时荧光PCR检测八角成分的引物为：
[0045] 上游引物PI :GGGTTGGTAGGTTCATAA
[0046] 下游引物P2 :GCACTCACACTTATATGTATA
[0047] 检测八角成分的荧光探针序列为:CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA
[0048] 上述荧光探针，5 '端为FAM标记，3 '端为TAMRA标记
[0049] 实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为：
[0050] 上游引物PI :CTCCCCCCTCCCTTGATC [0051 ]下游引物P2: CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG
[0052] 检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA
[0053] 上述荧光染料，5 '端为VIC标记，3 '端为MGB标记。
[0054] 2.样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行：
[0055] (1)分别称取0.5g八角和红毒茴粉碎后材料放入同一个50mL离心管中；
[0056] (2)加入预热的lOmLCTAB抽提裂解缓冲液（使用前加入20yL蛋白酶K、20yL RNA、 200μ〇3-巯基乙醇），振荡悬浮后65°C温浴lh，期间不断晃动，冷却至室温后，5000g离心 lOmin；
[0057] (3)取上清950yL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇（24:1)轻柔混匀静置 5min，12000rpm离心 15min;
[0058] (4)取上清750yL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇（24:1)轻柔混匀静置 5min，12000rpm离心 15min;
[0059] (5)取上清500yL加入1.5mL离心管中，加入300yL异丙醇，50yL乙酸钾溶液，轻轻颠 倒混勾，室温静置30min，12000rpm离心15min，弃上清；
[0060] (6)加入1.0mL70 %乙醇溶液，将沉淀悬浮浸泡，并将离心管倾斜，轻轻转动数圈后 室温静置2min，12000rpm离心1 Omin，弃上清，如沉淀多重复此步骤一次；
[0061 ] (7)小心弃去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100yL ddH20，65°C溶解DNA。
[0062] 也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
[0063] 3.建立实时荧光PCR扩增反应体系
[0064]将检测八角和红毒茴的上游引物、下游引物和探针分别稀释至lOwnol/L，然后等 体积合并为混合引物(探针），所述的实时荧光PCR反应体系为： 2xReal-time PCR 预混液 10μ1 上游混合引物（ΙΟμιτιοΙ/L) ΙμL 下游混合引物（ΙΟμ mol/L) ΙμL
[0065] 混合探针（l〇pmol/L) ΙμL 样品 DNA (l-lOOng/μΙ) 2μ1 ddH20 5μ1
[0066] 在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，瞬离5s-10s〇
[0067] 将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
[0068] 循环条件设置：95°C 10min，l个循环；95°C 15s，58°C 30s，40个循环，设立FAM和 VIC双通道，在每次循环的58°C 30s时收集荧光，检测完毕后，根据扩增曲线和Ct值判定结 果。
[0069] 4.所述确定质量控制指标
[0070] 空白对照：以ddH20为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC 通道检测Ct值大于或等于40;
[0071]阴性对照：以八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光 PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
[0072]阳性对照：以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时 荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36;
[0073] 1.结果判定：
[0074]待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照，阳性对照和空白 对照结果正常者，判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分；
[0075] 待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照，阳性对照和空白 对照结果正常者，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分；
[0076] 待测样品FAM和（或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次 扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出八 角和(或）红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结 果正常，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
[0077] 2.检测结果：
[0078]本发明实施例1将待检八角和红毒茴样品混合提取DNA后，进行实时荧光PCR检测， 含有八角和红毒茴的样品显示如图1所示的阳性扩增曲线，表明该引物探针能对八角和红 毒茴成分进行良好扩增。
[0079] 实施例2
[0080] 1.所用引物和探针：
[0081] 选择八角微卫星序列和红毒茴ITS2基因作为对象，设计并合成实时荧光PCR特异 性扩增引物和探针。
[0082]实时荧光PCR检测八角成分的引物为：
[0083] 上游引物PI :GGGTTGGTAGGTTCATAA
[0084] 下游引物P2 :GCACTCACACTTATATGTATA
[0085] 检测八角成分的荧光探针序列为:CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA
[0086] 上述荧光探针，5 '端为FAM标记，3 '端为TAMRA标记
[0087] 实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为：
[0088] 上游引物PI :CTCCCCCCTCCCTTGATC
[0089] 下游引物P2: CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG
[0090] 检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA
[0091] 上述荧光染料，5 '端为VIC标记，3 '端为MGB标记。
[0092]样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行：
[0093] (1)分别称取0.5g八角、红毒茴、地楓皮和大八角等样品粉碎后材料放入不同50mL 离心管中；
[0094] (2)加入预热的lOmLCTAB抽提裂解缓冲液（使用前加入20yL蛋白酶K、20yL RNA、 200μ〇3-巯基乙醇），振荡悬浮后65°C温浴lh，期间不断晃动，冷却至室温后，5000g离心 lOmin；
[0095] (3)取上清950yL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇（24:1)轻柔混匀静置 5rnin，12000rpm 离心 15min;
[0096] (4)取上清750yL加入2mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇（24:1)轻柔混匀静置 5rnin，12000rpm 离心 15min;
[0097] (5)取上清500yL加入1.5mL离心管中，加入300yL异丙醇，50yL乙酸钾溶液，轻轻颠 倒混勾，室温静置30min，12000rpm离心15min，弃上清；
[0098] (6)加入1.0mL70 %乙醇溶液，将沉淀悬浮浸泡，并将离心管倾斜，轻轻转动数圈后 室温静置2min，12000rpm离心1 Omin，弃上清，如沉淀多重复此步骤一次；
[0099] (7)小心弃去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100yL ddH20，65°C溶解DNA。
[0100] 也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
[0101] 2.建立实时荧光PCR扩增反应体系
[0102] 将检测八角和红毒茴的上游引物、下游引物和探针分别稀释至ΙΟμ mol/L，然后等 体积合并为混合引物(探针），所述的实时荧光PCR反应体系为： 2xReal-timePCR 预混液 10μ1 上游混合引物（1 Ομιηο?/L ) 1 μL 下游混合引物（ΙΟμL?θΙ/L) ΙμL
[0103] 混合探针（10μL?〇1/υ ΙμL 样品 DNA (l~100ng/pl) 2μ1 ddH2〇 5μ1
[0104] 在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，瞬离5s-10s〇
[0105] 将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
[0106] 循环条件设置：95°C 10min，l个循环；95°C 15s，58°C 30s，40个循环，设立FAM和 VIC双通道，在每次循环的58°C 30s时收集荧光，检测完毕后，根据扩增曲线和Ct值判定结 果。
[0107] 3.所述确定质量控制指标
[0108] 空白对照：以ddH20为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC 通道检测Ct值大于或等于40;
[0109] 阴性对照：以八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光 PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
[0110] 阳性对照：以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时 荧光PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36;
[0111] 1.结果判定：
[0112] 待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照，阳性对照和空白 对照结果正常者，判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分；
[0113] 待测样品基因 FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照，阳性对照和 空白对照结果正常者，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分；
[0114] 待测样品FAM和（或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次 扩增后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出八 角和(或）红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结 果正常，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
[0115] 2.检测结果：
[0116] 本发明实施例2将八角和红毒茴成分检测引物和探针分别对八角、红毒茴、地楓皮 和大八角等DNA进行实时荧光PCR检测，结果显示样品地楓皮和大八角无扩增信号，只有八 角和红毒茴有扩增信号，实施例2表明本发明的引物和探针具有良好的特异性。
[0117] 上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制;应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和 变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修 饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。
【主权项】
1. 一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，其特征为，实时荧光PCR检测八角和红毒茴 成分的引物探针，分别为： 实时荧光PCR检测八角成分的引物为:上游引物P1: GGGTTGGTAGGTTCATAA，下游引物P2: GCACTCACACTTATATGTATA，检测八角成分的荧光探针序列为： CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA； 上述荧光探针，5 '端为FAM标记，3 '端为TAMRA标记； 实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为：上游引物PI: CTCCCCCCTCCCTTGATC，下游引物 P2: CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG，检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA 上述荧光染料，5 '端为VIC标记，3 '端为MGB标记。2. 根据权利要求1所述的一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，其特征在于:检测八 角成分探针的荧光染料为:5 '端为FAM标记，3 '端为MGB标记;检测红毒茴成分探针的荧光染 料为:5 '端为VIC标记，3 '端为MGB标记。3. 根据权利要求1所述的一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，其特征在于如下步 骤： 1) 提取待检样品基因组DNA; 2) 以所提取的DNA作为模板，加入权利要求1所述的引物对和荧光染料标记的探针以及 酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值。4. 根据权利要求3所述的一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，其特征在于:将检测 八角和红毒茴的上游引物、下游引物和探针分别稀释至lOMiol/L，然后等体积合并为混合 引物(探针），所述的实时荧光PCR反应体系为： 2 xReal-time PCR 预混液 1 ΟμL 上游混合引物（ΙΟμιτιοΙ/L) ΙμL 下游混合引物（10μL?〇1/υ ΙμL ο 混合探针（ΙΟμιτιοΙ/L) ΙμL 样品 DNA (l-lOOng/μΙ) 2μ1 ddH20 5μ15. 根据权利要求4所述的一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，其特征在于:所述的 实时荧光PCR反应条件为95°C lOmin，1个循环;95°C 15s，58°C30s，40个循环。6. 根据权利要求3、4和5所述的一种快速检测八角和红毒茴成分的方法，其特征在于： 所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为： 空白对照：以ddH20为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR反应，FAM和VIC通道检 测Ct值大于或等于40; 阴性对照：以非八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光PCR 反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40; 阳性对照：以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板，按照2和3所述条件，进行实时荧光 PCR反应，FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36; 待测样品FAM和（或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照，阳性对照和空白对照 结果正常者，判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分； 待测样品FAM和（或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照，阳性对照和空白对照 结果正常者，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分； 待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增 后结果Ct值大于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出八角和 (或）红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正 常，判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
【文档编号】C12Q1/68GK105950767SQ201610516836
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】宋薇, 张斌, 崔山, 闫涛, 郭文宗
【申请人】杭州谱尼检测科技有限公司