同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法

同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法
【专利摘要】一种同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法。包括：(1)单细胞的捕获和裂解；(2)单细胞mRNA和gDNA的分离；(3)单细胞mRNA的扩增和端粒特异性序列的扩增；(4)qPCR检测单细胞基因表达；(5)单细胞相对端粒长度的检测。该方法可以有效地对单细胞进行裂解并释放完整的mRNA和gDNA，然后用生物素标记的引物捕获mRNA，磁珠吸附生物素后将mRNA和gDNA进行物理分离，对单细胞的基因表达和长度分别进行检测，最后可获得同一个细胞的基因表达水平和端粒长度并进行关联分析。本发明所述检测方法准确性和灵敏度高，方法简便，可在单细胞水平对哺乳动物各种细胞进行平行的基因表达和端粒长度检测。
【专利说明】
同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物分子技术领域，具体涉及同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长 度的方法。
【背景技术】
[0002] 单细胞技术是近几年发展起来的新的方法，单细胞技术是相对于我们之前的以整 个细胞群体为研究对象而言的。以往我们都是以一个细胞群体为单位从DNA和RNA水平对生 物学现象进行研究，但是由于群体细胞异质性的存在，每个细胞群中的细胞不都是一模一 样的。以肿瘤细胞为例，一个肿瘤组织混杂有基质细胞、血细胞、免疫细胞、肿瘤干细胞等， 这其中肿瘤干细胞往往在肿瘤的发生发展中起着关键作用，但是肿瘤干细胞的数目非常稀 少，这样以传统的群体对象对肿瘤组织进行研究，就会使得我们不能把握关键的信息。另外 对于稀少的珍贵样品的研究，以往的群体研究手段都需要大量的细胞，而单细胞技术可以 很好的克服这一瓶颈。
[0003] 某一特定时段，由细胞以基因组DNA为模板转录出来的所有的转录产物称为转录 组，其中mRNA可以进一步翻译成蛋白质，从而发挥重要功能。正如以上所述，以往的转录学 技术也都是以群体为研究对象，这样将大量细胞的基因表达平均化进行分析，使得我们无 法揭示不同细胞之间基因表达的异质性，而对于胚胎细胞这些稀有珍贵的细胞也无能为 力。
[0004] 端粒是存在于染色体末端的重复序列，由TTAGGG重复片段构成，其长度在不同组 织和细胞类型中不同，平均长度分布在3_21kb，端粒结构稳定和长度的维持是细胞进行持 续增殖的必要条件之一。端粒长度异质性与细胞的功能密切相关，目前群体细胞端粒长度 的测量方式主要有TRF(Kimura et al.，2010)、qFISH(Lansdorp et al.，1996)、Flow-FISH (Hultdin et al.，1998)、T/S qPCR(Cawthon，2002)，但是这些方法都是以细胞群体为研究 对象，而且需要大量的起始细胞数目。另外对于稀有样品也没有办法进行分析，并且不能对 单个细胞的端粒长度进行准确测量。
[0005] 目前主要存在的技术问题：
[0006] 目前测量端粒的方法需要大量的gDNA或者大量的细胞数目，对单个细胞和微量 gDNA不适用，虽然目前单独的检测单细胞mRNA表达水平的方法已经建立，我们实验室也建 立了分析单个细胞端粒长度的方法，但是还没有办法做到同时对同一个细胞的mRNA表达水 平和端粒长度进行检测。而仅仅依靠直接高速离心的方法来分离单细胞的细胞核和细胞， 由于细胞核中也存在mRNA，这样就会造成较大的误差。

【发明内容】

[0007] 本发明目的是解决在单细胞水平同时进行端粒长度和mRNA基因表达谱关联分析 的问题，提供一种同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法。
[0008] 本发明将在实验室之前建立的单细胞端粒长度检测技术的基础上，通过有效分离 单细胞mRNA和gDNA，结合高效的单细胞Smart-seq2转录组扩增技术来用一个单细胞对端粒 长度和mRNA基因表达谱关联进行分析，为更加深入研究单细胞异质性提供参考。
[0009] 本发明技术方案
[0010] 为了达到同时检测同一个细胞的端粒长度和转录组表达谱，本发明设计了如下方 案(见图1):
[0011] 第1步、同时获得完整的gDNA和RNA，采用Qiagen RLT Plus裂解单细胞以达到同时 释放gDNA和RNA的目的，使用生物素标记的Oligo-dT对含有Ploy(A)的mRNA进行杂交捕获；
[0012] 第2步、使用能够特异性吸附生物素的磁珠将mRNA和gDNA进行分离，上清中即为游 离的gDNA，管壁磁珠中为mRNA;
[0013] 第3步、将管壁磁珠中分离获得的单细胞mRNA进行反转录成第一链cDNA，并对其进 行扩增，扩增产物纯化后，对看家基因 GAPDH和Actin表达情况进行qPCR调查，排除看家基因 未被扩增的单细胞样品；
[0014] 第4步、将上清中的gDNA全部转移至新的PCR管中，纯化后用EB溶解gDNA，然后直接 向管中加入端粒和内参基因 Alu引物进行预扩增反应，对扩增产物进行纯化后分别用于端 粒和Alu的qPCR定量分析。
[0015] 本发明的优点和积极效果：
[0016] 本发明能够同时对单个细胞的mRNA表达水平和端粒长度进行检测，操作简便，结 果可靠，通量高耗费低。
【附图说明】
[0017] 图1是单细胞同时检测端粒长度和RNA-seq的基本流程。
[0018] 图2是单细胞同时检测端粒长度和mRNA表达技术的质量控制。(A)进行18个循环的 单细胞Tel和Alu预扩增后，对Tel和Alu进行qPCR定量分析，同时以roS和Water作为阴性对 照。（B)使用Smat- Seq2扩增同一个单细胞的mRNA，对扩增获得的dscDNA进行纯化和浓度测 定用于qPCR定量分析GATOH和0CT4基因的表达，同时以roS和Water作为阴性对照。（C)单细 胞端粒qPCR定量分析的端粒扩增曲线。（D)单细胞端粒qPCR定量分析的端粒溶解曲线。（E) 单细胞端粒qPCR定量分析的端粒扩增曲线。（F)用于评价同一次实验Tel和Alu扩增效率的 标准品Ct值与DNA上样量的标准曲线。S1-S5为标准曲线，总gDNA上样量依次为100ng，20ng， 4ng，0.8ng，0.16ng。
[0019]图3是scTel&RNA-seq技术分析六种人细胞系的端粒长度异质性和与群体端粒长 度相关性分析。（A)-(F)分别为人胚胎干细胞WA26、RUES2、骨肉瘤细胞系U20S、结肠癌细胞 系HCT116、宫颈癌细胞系He La、人胚胎成纤维细胞系HEF和Mean 土 SD。（G) Southern blot杂 交TRF定量人不同细胞系的端粒长度。（H)T/S ratio qPCR的方法定量人不同细胞系的相对 端粒长度。（DscTel&RNA-seq单细胞端粒长度的平均值。（J)TRF杂交定量的群体细胞端粒 实际平均长度与T/S ratio qPCR定量相对长度的相关性。（K)单细胞端粒长度与TRF杂交定 量的群体细胞端粒的相关性。（L)单细胞端粒长度与T/S ratio qPCR定量相对端粒长度的 相关性。
[0020] 图4是单细胞Smart-seq2扩增后qPCR验证单细胞GATOH基因表达水平，qPCR循环数 为40,对扩增产物进行2%凝胶电泳分析，条带均为单一条带。
[0021] 图5是scTel&RNA-seq检测人胚胎干细胞WA26的0CT4和TRF1的基因表达水平与对 应的端粒长度。(A)单细胞GAPDH的Ct值。（B)单细胞0CT4的Ct值。（C)单细胞TRF1的Ct值。（D) 单细胞0CT4相对基因表达水平，以GAPDH为内参。（E)单细胞TRF1相对基因表达水平，以 GAPDH为内参。总共扩增94个WA26单细胞，以GAPDH判断有9个单细胞mRNA未被扩增，不用于 后续分析，扩增成功率为91.5%。斤^?0?检测的单细胞端粒Ct值。（G)qPCR检测的单细胞 Alu基因 Ct值。（H)单细胞端粒相对长度的定量分析。S1-S5为标准曲线，总gDNA上样量依次 为100ng，20ng，4ng，0.8ng，0.16ng。以Tel Ct值判断有5个单细胞未被扩增，不用于后续分 析，扩增成功率为94.7 %。总共扩增94个WA26单细胞，NTC1为PBS，NTC2为Water。
[0022] 图6是单细胞基因表达水平与单细胞端粒长度的相关性和异质性分析。(A)and(B) 将85个有效扩增的细胞分成高中低三个群，每个群体间的平均值具有显著性差异。不管是 0CT4还是TRF1，相对表达水平高的细胞数目都是很少的，而大部分细胞都集中在中和低水 平。（C)将单细胞端粒长度分成4个不同的区间，4个区间均显示出了显著性差异。(D)0CT4与 TRF1的共表达情况分析。（E)单细胞端粒长度与0CT4的共表达情况分析。（F)单细胞端粒长 度与TRF1的共表达情况分析。（G-J)不同端粒长度区间[0.0-0.4]，[0.4-0.8]，[0.8-2.1]， [2.1 -5.0 ]中单细胞端粒长度与对应0CT4基因表达相关性的分析。(K-N)不同端粒长度区间 中单细胞端粒长度与对应TRF1基因表达相关性的分析。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1、同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法
[0024] 本发明方法的具体操作步骤如下：
[0025] 步骤1、磁珠分离单细胞基因组gDNA和mRNA
[0026] 注意:本步骤中的用于孵育的PCR仪热盖温度为105°C。使用RnaseZap和DNA-0FF擦 拭PCR级别超净工作台。RnaseZap擦拭所使用的移液器。保证所用的试剂盒物品都是Rnase free和无 DNA污染。实验时穿戴白大褂，发罩，口罩，鞋罩，手套。
[0027] 1)首先向PCR样品管中分装好4yL的裂解液，裂解液的配方为:2.5yL的Buffer RLT plus裂解液，lyL浓度为ΙΟμΜ的Biotin-〇lig〇-dT，0.03yL的 L的水；
[0028] 2)将所需要的细胞重悬成单细胞，并将其稀释至10倍物镜下能够找到2-3个细胞 的浓度，使用口吸管、流式分选仪或者其他可取的设备分选单个细胞到步骤1)中准备好的 PCR管中，加入的体积最大为lyL;
[0029] 3)迅速小心涡旋，室温700g离心10秒，立即置于冰上；
[0030] 4)在带热盖的PCR仪中72°C孵育3分钟，结束后立即置于冰上5分钟；
[0031] 5)室温700g离心10秒，立即置于冰上;此时Biotin-oligo-dT引物已经杂交到含有 poly (A)的mRNA 上；
[0032] 6)按照1:1的比例加入5以1^的链霉亲和素磁珠 .13抑313.抑43(5^7〇1161￥31:代。丨3￥丨(1;[11 C1室温孵育20分钟；
[0033] 7)结束后将PCR管置于96孔贝克曼磁体上静置8分钟，沉淀吸附mRNA，将上清转到 新的PCR管中，对含mRNA的PCR管使用10yL以下缓冲液清洗2次后，都转到装gDNA的PCR管中， 最终即分别获得了用一个单细胞的mRNA和gDNA样品；清洗缓冲液配方是:2.5ml的1M Tris- !1(：1，25以1^的311((：1，15(^1^的謂1%(：12,50(^1^的謂01'1'，25(^1^的100%了￥6611-20，总体积为 50ml，临用前按照1:40加入RRI;
[0034] 步骤2、单细胞mRNA的扩增
[0035] 1)向步骤1-7)得到的mRNA磁珠沉淀中加入10yL的单细胞反转录混合液:0.5yL的 200UyL-Superscript II reverse transcriptase，0.25yL的dOUyL-iRRIJyL的5X Superscript II first-strand bufTer，0.5yL的lOOmM DTT，2.0yL的5M Betaine，0.06yL 的 1M MgCl2,0.1yL的100μΜ TSO引物，4.59yL水，总体积 10yL;
[0036] 2)室温700g离心10秒，置于PCR仪上进行如下循环，42 °C 90min，50 °C 2min、42 °C 2min，10个循环，70°C 15min，4°C保存;所得产物即为第一链cDNA;
[0037] 3)反转结束后，立即进行以下的扩增步骤，直接向以上步骤2-2)的反应液中加入 15yL的扩增体系；扩增体系为：12.5yL 2XKAPA HiFi HotStart Ready Mix，0.25yL的 10μΜ ISPCR引物，2.25yL 水；
[0038] 4)使用以下程序进行 ΡΟ?:98Γ3π?η，98Γ2〇8、67Γ?58、72Γ6π?η，18-22 个循环， 72°C5min，4°C保存;此步骤的循环数根据细胞类型需要调整，结束后即获得双链dscDNA;
[0039] 5)反应结束后进行双链cDNA的纯化，涡旋震荡混匀AMPure XP beads，室温放置 30min，按照1:1的比例向以上步骤2-4) PCR产物中加入25yL磁珠，室温孵育5分钟；磁珠用 200yL新鲜配制的80 %乙醇漂洗两次，最后加入25yL灭菌超纯水洗脱，于-20°C保存备用；
[0040] 6)对纯化产物使用QuBit测定浓度，将所有样品调整成浓度为0.5ngAiL，体积为50 yL，用于qPCR检测，20yL qPCR体系中加入5yL的dscDNA，最后以GAPDH作为内参，按照2-AACt 计算基因相对表达水平；
[00411步骤3、单细胞端粒长度的检测
[0042] 1)将以上步骤1-7)分离获得的gDNA按1:0.6比例加入AMPure XP beads进行纯化， 最后用1 OyL水洗脱；
[0043] 2)向洗脱液中直接加入15yL以下的单细胞端粒长度检测预扩增体系：2.5yL 10X iTaq buffer，0.75yL的50mM MgCl2,0.5yL的 10μΜ dNTP混合液，0.5yL的 10μΜ Tel-F/R引物 混合液，〇.5yL的10μΜ Alu-F/R引物混合液，10.125yL水，0.125yL的5U iTaq DNA polymerase，总反应体系为25yL;
[0044] 3)按照以下的程序进行PCR预扩增:95 °C 3分钟，95 °C 30秒、60 °C 30秒，18个循环，72 °C30秒，10°C保存；
[0045] 4)预扩增结束后按照1:1.8比例加入步骤3-3从1^11代乂？&6&(18纯化预扩增产物， 最后加入64yL的水洗脱预扩增产物；
[0046] 5)按照以下的20yL体系进行qPCR检测Tel和Alu，10yL 2XSYBR green Supermix， 上游下游引物各0.5μΜ，4yL水，步骤3-4)扩增产物5yL;
[0047] 6)按照以下qPCR程序进行单细胞端粒长度的定量分析，95 °C 10min，95 °C 15s、60 °C lmin，40个循环，溶解曲线为55°C到95°C80个循环；
[0048] 7)单细胞端粒长度的计算方法:首先根据标准曲线，判断Tel和Alu的扩增效率，当 两者效率均接近100%时，则按照Ct值的方法计算相对的端粒长度。
[0049] 实施例2:效果杨峥
[0050] 同时检测单细胞端粒长度和RNA-seq(scT&R-seq)的方法
[0051]为了达到同时检测同一个细胞的端粒长度和转录组表达谱，我们设计了图1中所 示的方案：
[0052] 首先同时获得完整的gDNA和RNA，我们采用Qiagen RLT Plus裂解单细胞以达到同 时释放gDNA和RNA的目的，使用生物素(Biotin)标记的01ig〇-dT对含有Ploy(A)的mRNA进行 杂交捕获。
[0053] 随后，使用Biotin特异性吸附的磁珠将mRNA和gDNA进行分离，上清中即为游离的 gDNA，管壁磁珠中为mRNA。
[0054]最后，将分离获得的mRNA按照Smart-seq2的方法进行转录组的扩增，对扩增产物 进行看家基因表达(GAPDH，Actin)情况进行qPCR调查，后续实验中剔除内参基因未被扩增 的样品，对合格的样品进行选择性的qPCR分析或者直接进行二代测序分析。
[0055]将上清中的gDNA全部转移至新的PCR管中，并用磁珠进行两次纯化去除影响后续 PCR反应的残留试剂，最后用EB溶解gDNA，直接向管中加入同时扩增端粒和Alu序列的PCR预 混液，对扩增产物进行纯化后分别用于端粒和Alu的qPCR定量分析。
[0056] 具体过程如图1所示，使用口吸管或者FACS等任何可以有效分离单细胞的装置将 单个细胞分装进单独的管子中，管中提取分装好裂解液，裂解液中含有生物素标记的Oligo dT，PCR中杂交5分钟后，Oligo dT即结合到含有Poly(A)尾巴的mRNA上，随后向其中加入含 有链霉亲和素标记的磁珠，特异性的将生物素标记的mRNA捕获，再将管子放在磁体上进行 孵育，mRNA则被吸附在管壁，而gDNA不被吸附游离在上清中，最后将上清转移至一个新的管 子中进行单细胞端粒长度方法扩增，剩下的mRNA则立即进行Smart_seq2的单细胞扩增。对 最终扩增获得双链cDNA进行质量评价，即可用于qPCR分析或者直接进行高通量的测序分 析。对最终获得T/R扩增产物进行纯化后用于单细胞相对端粒长度的检测。
[0057] 一、scT&R_seq技术的质量控制
[0058]我们首先用一种端粒重组机制阳性的肿瘤细胞系U20S(具有非常长的端粒长度） 和一种hESC(WA26)进行实验。每个细胞系挑取6个单细胞，同时以PBS和Water作为对照，按 照以上的方法进行操作，Smart_seq2的dscDNA扩增循环数为20，T/R ratio预扩增循环数为 18(图2A)。对照（PBS和Water)的Tel和Alu的Ct值均在20以上，对于Ct值在20以上的细胞样 品则判断为端粒未被扩增，而能够被扩增的样品，其Ct值要在20以下。对同一个样品同时扩 增后的dsDNA进行内参基因 GATOH和多能性基因0CT4的qPCR定量分析，结果表明GAPDH的Ct 均接近15,而0CT4Ct在肿瘤细胞U20S中很高，超过35,而在人胚胎干细胞WA26中Ct值在12左 右，这与细胞群体的qPCR结果一致（（图2B)。我们使用群体细胞HEF的gDNA作为标准品，来评 价每次的扩增效率，结果表明单细胞的端粒扩增Ct值均落在标准曲线内，而对照组(PBS， Water)的扩增曲线则偏离标准品（（图2C)，且端粒Tel的溶解曲线与标准品的曲线完全一致 ((图2D)。内参基因 Alu的扩增情况也与端粒leis((图2E)，标准品的Tel和Alu扩增的Ct值与 gDNA上样量相关性均为0.99，效率均在100 %左右（（图2F)。
[0059]二、scT&R-seq分析人不同细胞系的端粒长度和异质性
[0060]在初步建立同时检测端粒长度和mRNA表达水平方法后，我们首先选取人的不同类 型细胞系来验证方法的可靠性（图.3)。结果表明不同的细胞系表现了不同的端粒长度异质 性（图.3A-F)，端粒重组机制的U20S细胞间端粒长度差异最大（SD = 0.5)，结肠癌细胞系 HCT116和胚胎成纤维细胞系HEF差异最小。而且U20S的单细胞端粒长度普遍比其他细胞系 单细胞端粒长(图.3G)，并且通过端粒长度检测金标准TRF和qPCR的方法获得的群体结构也 表明U20S具有最长的单细胞长度（图.3H and 31)。相对于其他的细胞，hESC具有较长的端 粒长度，其次是HEF和HeLa，结肠癌细胞系HCT116的端粒最短，TRF显示其平均端粒长度只有 3.5kb(图.3H)。相关性分析显示，TRF检测结果与qPCR检测端粒长度(T/S ratio)的结果具 有非常高的相关性，达到了〇.918(P = 0.0026)(图.3J)，而TRF与T/R ratio的也有极显著的 相关性为〇·933(Ρ = 0.0017)(图.3K)，T/R ratio与T/S ratio相关性为0·787(Ρ = 0.0183) (图.3L)，以上结果表明scT&R-seq检测单细胞端粒长度是可靠的和准确的。
[0061 ] 三、scTel&RNA-seq检测人胚胎干细胞WA26的0CT4和TRF1的基因表达和端粒长度 异质性。
[0062] 我们的结果表明端粒长度的异质性普遍存在于人的不同细胞系中，我们进一步使 用scTel&RNA-seq来研究端粒长度异质性与hESC WA26多能性基因0CT4和TRF1表达的相关 性（图5)。总共挑选了94个WA26单细胞，使用scTel&RNA-seq方法同时扩增单细胞的mRNA和 端粒序列。以GAPDH的扩增情况来判断mRNA是否被扩增(Ct值大于26)，结果有85个单细胞获 得好的扩增效果（图5A)，并且对qPCR产物进行凝胶电泳判断条带大小和单一性，结果表明 与判断的情况一致，对照无目的条带，判定为未被扩增的样品无目的条带或大小不一致(图 4)，扩增成功率为91.5% (图5A)。同时进行0CT4和TRF1基因的表达分析（图5B and C)，最后 以GATOH作为内参，计算每个细胞的相对基因表达水平（图5D and E)，结果表明0CT4和TRF1 在不同的细胞中显示出了极大的异质性。以Tel或Alu的Ct值大于20判断gDNA未被扩增（图 5F and G)，结果显示有9个细胞的gDNA未被扩增，同样的单细胞长度也显示了高的异质性 (图5H)。同时mRNA和gDNA均未被扩增的细胞有1个，在后续分析中，这些未被扩增的细胞将 被过滤掉。
[0063] 四.单细胞基因表达水平与单细胞端粒长度异质性的相关性分析
[0064]对0CT4和TRF1基因表达水平进行分析后发现，这85个有效扩增的细胞可以明显分 成高中低三个群(细胞数分别为6,23,56)，且每个群体间的具有显著性差异。不管是0(^4还 是TRF 1，相对表达水平高的的细胞数目都是很少的（7 %左右），而大部分细胞都集中在中低 水平（图6A and B)。同样的单细胞的端粒长度也可以划分成4个明显差异的细胞群体，大部 分的细胞的端粒长度集中在〇. 4-2.1范围（53个），短端粒的细胞数有18个，特别长端粒的有 14个（图6〇。0(^4和TRF1的基因共表达分析结果表明，WA26细胞系中0CT4与TRF1具有低的 相关性，相关性系数R为0.2781 (P = 0.01 )，以Low表达值进行截断将细胞划分为4个区域，结 果表明同时高表达0CT4和TRF1的细胞数为10个（占11.76%)，0(^4和了1^1单独高表达的分 别占到20% (17个)和15.29(13个）（图6D)。同时我们发现单细胞端粒长度与0CT4基因表达 水平没有显著相关性，相关系数R为0.08771 (P = 0.4481)(图6E)。但是单细胞端粒长度与 TRF1基因表达水平显示出了极显著的相关性，相关系数R为0.745(P〈0.0001)(图6E)。进一 步对不同端粒长度的细胞群体中0CT4和TRF1基因表达的相关性进行分析（图6G-N)，结果表 明不同端粒长度的细胞0CT4与端粒长度的正相关性不高，特别是端粒相对较短的细胞群体 中，呈现除了负相关的趋势（图61 and JhTRFl基因表达与单细胞端粒长度有一定相关性， 特别是长端粒的细胞，与端粒长度范围在2.1-5.0的相关性为0.4624(? = 0.0960)(图61〇， 与范围在0.8-2.1的相关性0.5365(? = 0.0015)(图6〇，而与短端粒范围（0.0-0.8)的相关 性不高（图6M and N)。
[0065] 参考文献
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【主权项】
1. 一种同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法，该方法包括： 第1步、同时获得完整的gDNA和RNA，采用Qiagen RLT Plus裂解单细胞以达到同时释放 gDNA和RNA的目的，使用生物素标记的Oligo-dT对含有Ploy(A)的mRNA进行杂交捕获； 第2步、使用能够特异性吸附生物素的磁珠将mRNA和gDNA进行分离，上清中即为游离的 gDNA，管壁磁珠中为mRNA; 第3步、将管壁磁珠中分离获得的单细胞mRNA进行反转录成第一链cDNA，并对其进行扩 增，扩增产物纯化后，对看家基因 GATOH和Actin表达情况进行qPCR调查，排除看家基因未被 扩增的单细胞样品； 第4步、将上清中的gDNA全部转移至新的PCR管中，纯化后用EB溶解gDNA，然后直接向管 中加入端粒和内参基因 Alu引物进行预扩增反应，对扩增产物进行纯化后分别用于端粒和 Alu的qPCR定量分析。2. 根据权利要求1所述的同时检测单细胞mRNA表达水平和端粒长度的方法，其特征在 于该方法的具体操作步骤如下： 步骤1、磁珠分离单细胞基因组gDNA和mRNA 1) 首先向PCR样品管中分装好4yL的裂解液，裂解液的配方为：2.5yL的Buffer RLT plus裂解液，lyL浓度为ΙΟμΜ的Biotin-〇lig〇-dT，0.03yL的 L的水； 2) 将所需要的细胞重悬成单细胞，并将其稀释至10倍物镜下能够找到2-3个细胞的浓 度，使用口吸管、流式分选仪或者其他可取的设备分选单个细胞到步骤1)中准备好的PCR管 中，加入的体积最大为lyL; 3) 迅速小心涡旋，室温700g离心10秒，立即置于冰上； 4) 在带热盖的PCR仪中72°C孵育3分钟，结束后立即置于冰上5分钟； 5) 室温700g离心10秒，立即置于冰上;此时Biotin-oligo-dT引物已经杂交到含有poly (A)的mRNA上； 6) 按照1:1的比例加入5yL的链霉亲和素磁珠 Dynabeads?MyOne?Str印tavidin Cl室温 孵育20分钟； 7) 结束后将PCR管置于96孔贝克曼磁体上静置8分钟，沉淀吸附mRNA，将上清转到新的 PCR管中，对含mRNA的PCR管使用10yL以下缓冲液清洗2次后，都转到装gDNA的PCR管中，最终 即分别获得了用一个单细胞的mRNA和gDNA样品；清洗缓冲液配方是:2.5ml的1M Tris-HCl， 25yL的 3M KCl，150yL的 1M MgC12,500yL的 1M DTT，250yL的 100%Tween-20,总体积为50ml， 临用前按照1:40加入RRI; 步骤2、单细胞mRNA的扩增 1) 向步骤1-7)得到的mRNA磁珠沉淀中加入10yL的单细胞反转录混合液:0.5yL的20〇υμ L-Superscript II reverse transcriptase，0· 25yL的dOUyL-iRRI，2yL的5 X Superscript II first-strand bufTer，0.5yL的lOOmM DTT，2.0yL的5M Betaine，0.06yL的1M MgCl2， 0 · lyL的 100μΜ TSO 引物，4 · 59yL水，总体积 1 OyL; 2) 室温700g离心10秒，置于PCR仪上进行如下循环，42 °C 90min，50 °C 2min、42 °C 2min，10 个循环，70°C 15min，4°C保存;所得产物即为第一链cDNA; 3) 反转结束后，立即进行以下的扩增步骤，直接向以上步骤2-2)的反应液中加入15yL 的扩增体系；扩增体系为：12.5yL 2XKAPA HiFi HotStart Ready Mix，0.25yL的 ΙΟμΜ ISPCR引物，2.25yL 水； 4) 使用以下程序进行？〇?:981€3111丨11，981€208、67°(：158、72 1€6111丨11，18-22个循环，721€ 5min，4°C保存;此步骤的循环数根据细胞类型需要调整，结束后即获得双链dscDNA; 5) 反应结束后进行双链cDNA的纯化，涡旋震荡混匀AMPure XP beads，室温放置30min， 按照1:1的比例向以上步骤2-4)PCR产物中加入25yL磁珠，室温孵育5分钟；磁珠用200yL新 鲜配制的80 %乙醇漂洗两次，最后加入25yL灭菌超纯水洗脱，于-20°C保存备用； 6) 对纯化产物使用QuBit测定浓度，将所有样品调整成浓度为0.5ngAiL，体积为50yL， 用于qPCR检测，20yL qPCR体系中加入5yL的dscDNA，最后以GAPDH作为内参，按照2^AGt计算 基因相对表达水平； 步骤3、单细胞端粒长度的检测 1) 将以上步骤1 -7)分离获得的gDNA按1:0.6比例加入AMPure XP beads进行纯化，最后 用10yL水洗脱； 2) 向洗脱液中直接加入15yL以下的单细胞端粒长度检测预扩增体系：2.5yL 10X iTaq buffer，0.75yL的50mM MgCl2,0.5yL的ΙΟμΜ dNTP混合液，0.5yL的ΙΟμΜ Tel-F/R引物混合 液，〇.5yL的ΙΟμΜ Alu-F/R引物混合液，10.125yL水，0.125yL的5U iTaq DNA polymerase， 总反应体系为25yL; 3) 按照以下的程序进行PCR预扩增:95 °C 3分钟，95 °C 30秒、60 °C 30秒，18个循环，72 °C 30 秒，10°C保存； 4) 预扩增结束后按照1:1.8比例加入步骤3-3)AMPure XP beads纯化预扩增产物，最后 加入64yL的水洗脱预扩增产物； 5) 按照以下的20yL体系进行qPCR检测Tel和Alu，10yL 2XSYBR green Supermix，上游 下游引物各〇. 5μΜ，4yL水，步骤3-4)扩增产物5yL; 6) 按照以下qPCR程序进行单细胞端粒长度的定量分析，95 °C 10min，95 °C 15s、60 °C lmin，40个循环，溶解曲线为55°C到95°C80个循环； 7) 单细胞端粒长度的计算方法:首先根据标准曲线，判断Tel和Alu的扩增效率，当两者 效率均接近100%时，则按照Ct值的方法计算相对的端粒长度。
【文档编号】C12Q1/68GK105950760SQ201610474118
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】王 华, 傅雨栋, 潘星华, 刘林
【申请人】南开大学