为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节的制作方法
【专利说明】为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节
[0001]本申请是申请日为2006年5月18日、申请号为200680024082.7、发明名称为“为预防和治疗癌症对癌细胞中端粒长度的药理学调节”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求2005年5月18日提交的美国临时申请N0.60/682, 110的优先权，申请60/682，110的文本全部引入本文作为参考。
技术领域
[0003]本发明涉及癌症治疗领域。具体地，本发明涉及癌细胞中端粒延长的调节。更具体地，本发明涉及无环(acyclic)核苷类似物在治疗或预防癌症中的用途。
【背景技术】
[0004]前导和后随DNA链合成中的不对称造成了线性基因组复制的“终止问题”1。为了克服这个问题，真核生物染色体具有特化的末端结构，即由TTAGGG重复序列组成的端粒2。端粒酶3，4是延长端粒并因此在细胞倍增期间保持大多数癌细胞的染色体稳定性的核糖核蛋白酶5。细胞倍增期间DNA从端粒末端的逐渐损失涉及体细胞中细胞增殖潜力的控制6。
[0005]培养的正常人类细胞在培养中具有有限的复制潜力。培养中的正常细胞进行复制，直到它们达到群体生长停止时的离散点。这被称为死亡期1(M1期)，是由于少数端粒缩短到导致被称为细胞老化的生长停滞的大小而引起的。能够通过消除P53和pRB人肿瘤抑制基因的功能而绕过这个阶段。之后该细胞可继续增殖而端粒长度进一步变短，直到另一个被称为死亡期2 (M2期)或转折期的限制点。M2期的生长停滞是由细胞增殖和细胞死亡速率之间的平衡引起的。在这个阶段，当大多数端粒非常短的时候，末端与末端的融合和染色体断裂一融合引起显著的染色体异常和细胞凋亡。在极少的情况下，细胞能够脱离M2并通过稳定其端粒的长度而变为无限增殖的。这是通过端粒酶活化或替代性端粒延长机制(即替代的端粒延长或ALT)而发生的7，8。
[0006]人类种系9和多数癌细胞3表达端粒酶。端粒酶对已缩短的端粒的延长是人类癌细胞中端粒维持的主要机制。对端粒酶的抑制通过缩短端粒的长度而限制人类端粒酶阳性癌细胞的生长n。
[0007]已经尝试利用核苷类似物(例如AZT)干扰人端粒酶活性以达到治疗癌症的目的。然而现有技术中公开的施用核苷类似物改变端粒酶活性的方法不能令人满意，或者不适合临床情况，因为它们的临床应用受到低治疗比(即毒性剂量与有效剂量之比)的限制。
[0008]此外，由于细胞(包括癌细胞)的增殖能力是由于端粒酶介导的端粒延长机制和/或ALT机制的激活，用于控制细胞增殖的理想的核苷类似物是对于这两种机制都有效并且对正常细胞和组织毒性最小或没有毒性的那些核苷类似物。因此，需要鉴定可以抑制增殖的细胞例如通过端粒酶和/或ALT机制维持其端粒的癌细胞的治疗性核苷类似物。
【发明内容】
[0009]本发明提供涉及使用抗病毒核苷类似物调节、抑制或阻止细胞中端粒延长的方法和组合物，而无论端粒延长机制如何(端粒酶或ALT机制)。本发明还公开了使用特定核苷类似物预防和/或治疗增生性疾病和所有类型的癌症的方法。更具体地，本发明公开了在对相应的正常体细胞没有细胞毒性的水平上可以干扰增殖的细胞、包括癌细胞(例如人类癌细胞)中的端粒酶活性和L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码的逆转录酶(LlRT)活性的无环核苷类似物。本发明公开了如何使用无环核苷类似物作为抗肿瘤剂或抗癌剂。在本发明的一个方面，已经发现用更昔洛韦、阿昔洛韦和/或喷昔洛韦处理端粒酶阳性或端粒酶阴性细胞(但是具有LlRT活性)诱导了进行性的端粒损失、G2期停滞、染色体异常和最终的细胞死亡。此外，这些抗肿瘤核苷类似物对端粒酶或LlRT具有惊人的效果，因为其临床上可接受的水平足以在增殖的细胞中控制端粒酶活性并且诱导细胞死亡，由此允许治疗或预防所有类型的癌症。
[0010]当前，在应用中还没有基于无环的、抗端粒酶、抗LlRT和抗肿瘤核苷类似物的治疗性组合物。申请人第一次披露了使用无环核苷类似物(在本文中也被称为端粒延长的抑制剂或拮抗剂)在体内抑制端粒延长在治疗上是有益的。而且，在本发明之前，本领域技术人员没有认识到可以预测这种处理具有治疗用途。
[0011]由于端粒酶参与控制细胞周期、细胞复制和老化，因此本发明的含有核苷类似物的组合物可以阻止或控制不受控制的细胞生长和肿瘤细胞的无限增殖性。本发明的组合物尤其可用于治疗细胞增殖性疾病，特别是以端粒酶或LlRT维持或延长端粒为特征的人类肿瘤。
[0012]因此，一方面，本发明提供了一种治疗与端粒酶或LlRT维持或延长端粒有关的、特别是与细胞中端粒酶或LlRT活性水平升高有关的疾病的方法。该方法包括给所述细胞或需要治疗的哺乳动物施用一种组合物，该组合物含有治疗有效量的至少一种为无环、抗端粒酶、抗LlRT和抗肿瘤剂的核苷类似物。细胞中的端粒酶活性或LlRT活性水平可以如以下文献中所述测定，例如:本申请人于2005年3月25日提交的名称为“Modulat1n OfTelomere Length In Telomerase Positive Cells For Cancer Therapy，，的美国专利申请 60/655，105，以及于 2005 年 I 月 18 日提交的名称为“Modulat1n Of Line-1 ReverseTranscriptase”的国际专利申请PCT/US05/001319，该专利申请引入本文作为参考。细胞中的端粒酶活性或LlRT活性水平也可以通过任意其他现有的方法或等同的方法测定。端粒酶活性或LlRT活性的“升高的水平”是指特定细胞中端粒酶活性或LlRT活性的绝对水平比受试者或个体的正常细胞升高，或者比未患该疾病的其他受试者或个体的正常细胞升高。这些疾病的例子包括癌性疾病，或与正常情况下不存在于个体中的细胞的存在有关的疾病。优选地，该组合物含有GCV或ACV或它们的前药。这些组合物(直接抑制端粒酶活性或LlRT活性，或者间接整合到端粒中从而阻止端粒进一步延长)的应用将在端粒酶具有活性的肿瘤中导致进行性的端粒缩短。一旦端粒长度缩短到临界长度，肿瘤就进入转折期并最终死亡。这些抑制剂对正常体细胞没有影响或者只有极小的影响，因为正常细胞中的端粒酶活性和/或LlRT活性通常较低或者检测不到。
[0013]干扰端粒的延长或维持可能直接导致细胞死亡或者可能加强最终通过凋亡杀死细胞的化疗剂的作用。特别地，本发明提供一种通过施用含有本发明的无环核苷类似物的组合物来抑制具有细胞数持续增长潜力的端粒酶/LlRT表达细胞增殖的方法。核苷类似物的施用可以通过本领域技术人员公知的任何期望的方法来实现。
[0014]在本发明的一个实施方案中，提供一种预防以需要该预防的哺乳动物或受试者(例如人)的细胞表达端粒酶或LlRT为特征的癌症的方法。该预防方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的组合物。该组合物含有本发明的端粒酶抑制剂或拮抗剂。该抑制剂或拮抗剂阻断端粒酶阳性/端粒酶阴性细胞中端粒的延长，由此抑制端粒酶表达细胞的增殖。该抑制剂是无环核苷类似物或这种类似物的药学上可接受的盐或富含该抑制剂或拮抗剂的液体或固体食品材料。该食品可以是，例如，黄油、人造黄油、饼干、面包、蛋糕、蜜饯、糖果、酸奶酪或其他发酵乳制品、或适于人类消费的谷类食品形式的功能性食物。或者可以是营养补充物、营养物、药品、食品、营养品、健康食品和/或特制食品。定时检测人体中端粒酶阳性细胞的存在。一旦在哺乳动物中不再检测到端粒酶阳性细胞，即可停止使用抑制剂或拮抗剂。
[0015]除了治疗方面以外，本发明还提供用于检测病理性增殖的表达端粒酶或LlRT的细胞的诊断方法和试剂盒。本发明的这些和其他实施方案将会在下文更详细地描述。
[0016]本发明涉及但不限于以下各项:
[0017]第I项.一种预防或治疗哺乳动物或人体中由于存在不适当地或病理性增殖的细胞或无限增殖细胞而引起的疾病或治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的人施用治疗有效量的包含一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0018]第2项.第I项的方法，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0019]第3项.第I项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0020]第4项.第I项的方法，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内或血管内施用。
[0021]第5项.第2项的方法，其中施用包含两种或多种所述核苷类似物的组合物。
[0022]第6项.第I项的方法，其中所述核苷类似物之一的施用量为每天大约10mg/kg体重到大约150mg/kg体重。
[0023]第7项.第I项的方法，其中所述核苷类似物与放射治疗和/或非核苷化疗剂联合施用。
[0024]第8项.一种干扰肿瘤细胞中端粒延长的方法，该方法包括给所述细胞施用有效量的无环核苷类似物。
[0025]第9项.第8项的方法，其中所述核苷类似物选自:阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦或其前药。
[0026]第10项.第9项的方法，其中所述核苷类似物与选自下组的不同类型的类似物联合施用:3’ -叠氮-2’，3’ -双脱氧胸苷(AZT)、2’，3’ -双脱氧肌苷(ddl)、2’，3’ -双脱氢_3’ -脱氧胸苷(d4T)，其中所述不同类型的类似物以低剂量存在，其单独时不足以终止端粒的延长。
[0027]第11项.第8项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0028]第12项.一种防止或抑制端粒酶阳性细胞生长的方法，该方法包括使细胞接触足量的无环核苷类似物。
[0029]第13项.第12项的方法，其中所述细胞与浓度为大约1.5 μΜ至3.0 μΜ的核苷类似物接触。
[0030]第14项.第12项的方法，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦、更昔洛韦或喷昔洛韦或其前药。
[0031]第15项.第12项的方法，其中所述端粒酶阳性细胞是癌细胞，其中所述癌细胞选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
[0032]第16项.一种在需要的人中预防癌症的方法，其中所述癌症是由于该人细胞中的端粒酶活性引起的，该方法包括给所述人施用治疗有效量的含有一种或多种无环核苷类似物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0033]第17项.第16项的方法，其中所述癌症选自:骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌和黑素瘤。
[0034]第18项.一种治疗患有癌症的个体的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的含有逆转录酶的抑制剂或拮抗剂的组合物，该逆转录酶由L-1 (LINE-1)逆转录转座子编码或是端粒酶逆转录酶(TERT)，并且与所述个体细胞中端粒的延长有关，其中该抑制剂或拮抗剂阻断所述端粒的延长，其中该抑制剂或措抗剂是选自阿昔洛韦、更昔洛韦、喂'昔洛韦或其前药的无环核苷类似物。
[0035]第19项.第18项的方法，其中所述癌症不包括移植后淋巴增生性疾病。
[0036]第20项.第19项的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。
[0037]第21项.第20项的方法，其中所述组合物通过口服、非肠胃、皮下、肌肉内、血管内或局