一种检测人类C-Kit基因11号外显子突变的诊断试剂盒和方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测人类c?kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～283所示的引物对和SEQ ID NO.284所示的探针。本发明还公开了一种检测人类c?kit基因11号外显子突变的方法。本发明试剂盒和方法可以准确检测人类c?kit基因11号外显子的所有突变类型，为GIST患者的用药提供指导，临床应用前景良好。
【专利说明】
一种检测人类C-K i t基因11号外显子突变的诊断试剂盒和 方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类c-Kit基因11号外显子突变的 诊断试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromaltumors，GIST)是一类起源于胃肠道间 叶组织的肿瘤，是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，多发于中老年患者，男女发病率无明显差 异。Mazur等在1983年提出，GIST是一类区别于平滑肌瘤和神经源性肿瘤的独立肿瘤类型， 其直接病因是癌基因获得性功能突变。
[0003] 早期治疗GIST主要依赖手术切除，但是即使肿瘤完全切除，也有很多患者死于肿 瘤的复发和转移，而传统的放疗和化疗也没有明显的疗效。靶向药物特别是酪氨酸激酶抑 制剂伊马替尼的出现使得GIST治疗发生了根本性的改变，现在对于GIST的治疗已发展为针 对不同病情，采取包括手术、辅助治疗和新辅助治疗的个性化综合治疗。目前临床上治疗 GIST的一线靶向药物是格列卫（伊马替尼，诺华制药），二线药物索坦(舒尼替尼，辉瑞制 药），每个患者年消费均为十余万人民币。
[0004] 但靶向药物的疗效与有GIST患者有无基因突变及突变位点密切相关，不同的基因 突变类型患者，辅助治疗的获益存在差异，因此靶向治疗之前需进行基因检测，以预测靶向 治疗的疗效并指导靶向药物种类和剂量的选用。其规范的用药方案已经进入《中国胃肠间 质瘤诊断治疗共识》(2013年版）。
[0005] GIST患者根据其基因突变类型，可从分子水平分为3类:C-Kit突变型（80~85%)， roGFRa突变型（5~10%)和野生型GIST(10%)。其中，C-Kit基因位于人染色体4ql2_13,全 长5230bp，含21个外显子。C-Kit基因的突变形式多样，包括缺失突变、点突变和插入突变， 突变位点主要发生在第9号（10%)、11号(70%)、13号（1%)、17号外显子(1%)。
[0006] 研究表明，C-Kit基因突变不仅可协助明确诊断GIST，而且其突变位点与GIST靶向 药物的治疗反应、用药剂量和预后有关。其中，从伊马替尼治疗反应上看，C-Kit基因有突变 的GIST病例比C-Kit野生型病例治疗反应效果好，患者肿瘤无明显进展的生存期长;其中， C-Kit基因有突变的GIST病例中，11号外显子突变患者对伊马替尼最敏感，药物疗效最好。 因此，检测GIST患者是否出现11号外显子突变，对于指导GIST患者的合理用药，以进行GIST 个体化诊疗，具有重要参考价值。
[0007] 但是，目前检测人类C-Kit基因11号外显子突变，主要是通过传统的测序方式，测 序的耗费时间长且成本高，不利用普通的临床检测。即使有少数使用荧光定量PCR法的报 道，也是仅对11号外显子的其中某一个位点进行检测，检测位点单一，无法对11号外显子进 行多突变位点的全面评估，不能满足实际应用的需要。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种新的定量PCR检测人类C-Kit基因突变的试剂盒和方 法。
[0009] c-Kit基因11号外显子是GIST患者中最易发生突变的外显子，突变几乎涉及该外 显子的每一个密码子。本发明设计的特定引物，可以用于检出已知11号外显子的所有突变 类型。
[0010] c-Kit基因11号外显子突变的部分已知突变类型如下：
[0013] 本发明提供了一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID N0.1~ 283所示的引物对和SEQ ID NO.284所示的探针。
[0014] 其中，它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.285~287所示引物对与SEQ ID NO. 284所示的探针。
[0015] 本发明还提供了上述试剂盒在制备检测人类C-kit基因11号外显子突变的试剂中 的用途。
[0016] 本发明还提供了SEQ ID NO. 1~283所示引物对。
[0017] 本发明还提供了SEQ ID N0.284所示的探针。
[0018]本发明还提供了一种检测人类c-kit基因11号外显子突变的方法，它包括如下步 骤：
[0019] (1)提取样本DNA:取待检组织，提取其中的DNA;
[0020] (2)基因扩增:用上述试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
[0021] (3)结果检测:对DNA扩增结果进行检测。
[0022]只要本发明检测试剂盒和方法测出有突变，就可以确认C-Kit基因的11号外显子 至少存在一种突变。从而可以预测GIST患者对靶向药物的治疗反应。
[0023]本发明提供的试剂盒可以同时准确检测待检人群是否出现C-Kit基因的11号外显 子上的274种突变位点，更能准确判断待检GIST患者的药物反应，为GIST患者的用药提供指 导，且灵敏度高，特异性好，而且检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前 景良好。
[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0025] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0026]图1为突变型样本测序结果图，所述突变为已知C11D组突变。
[0027]图2为特异性检测结果图。
[0028]图3为灵敏度检测结果图：编号1-5分别为浓度为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、lng/ul、 0.5ng/ul的DNA扩增结果。
【具体实施方式】
[0029] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0030] 本发明所用的实验试剂与仪器如下：
[0031] FastStartTaq DNA Polymerase:购自Roche公司，Cat No. 12 032 937 001;
[0032] Uracil DNA Glycosylase(UNG)，heat labile 200U 2u/l:购自大连Takara公司， Cat No.2820；
[0033] dU plus dNTP Mixture(12.5X)(dATP 2.5mM,dGTP 2.5mM,dCTP 2.5mM,dUTP 7 · 5mM,):购自大连Takara公司，Cat No · 4035。
[0034] 实施例1本发明检测C-Kit基因11号外显子突变的试剂盒和检测方法 [0035] 一、本发明试剂盒的组成
[0036] PCR扩增试剂(1人份）：
[0038] c-kit基因11号外显子突变的扩增引物以及检测探针：
[0039]引物如下：（引物均为5'-3'方向）
[0040](注:编号由三个数字+-个字母组成，其中，前两个数字代表第5XX位氨基酸;第三 个数字代表该氨基酸密码子的第几个核苷酸;字母代表突变为某种核苷酸。
[0041 ] 例如，471A代表第547位氨基酸的三联密码子第1个核苷酸突变为A。
[0042]本发明共涉及30个氨基酸的突变，共计274个突变位点）
[0043]
[0057]二、采用本发明试剂盒检测C-Kit基因 11号外显子突变
[0058] 1、样本DNA提取:可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取试剂盒 提取。
[0059]以石蜡组织样本，用Qiagen公司试剂盒为例，提取DNA。
[0060] 1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
[0061 ] 2)将石蜡包埋组织切成4μπι厚的薄片；
[0062] 3)迅速用灭菌小镊子取2-6枚装入DNase/RNase Free ΕΡ管中（每张摊开面积500 (最大)mm2,即边长1.6cm的正方形大小；
[0063] 4)加入800μ1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
[0064] 5)加入800μ1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
[0065] 6)弃二甲苯，加入800μ1无水乙醇，最大转数离心3分钟；
[0066] 7)弃无水乙醇，挥干样品；
[0067] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C -小时以上，直至清亮；
[0068] 9) 90 Γ -小时；
[0069] 10)离心6000g lmin，取上清；（此步骤是防止沉淀物阻塞柱子）
[0070] 11)加入200μ1 AL，混匀，加入200μ1乙醇，再混匀；
[0071] 12)简单离心清洁管壁；
[0072] 13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g lmin，换新的收集管；
[0073] 14)加入500μ1 AWl，6000g 离心 lmin;换收集管；
[0074] 15)加入500μ1 AW2,6000g 离心 lmin，换收集管；
[0075] 16)全速离心3min，干燥柱子；
[0076] 17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA;加入20-30μ1 ATE，在室温保持lmin 以溶解DNA。全速离心lmin收集DNA。
[0077] 2、定量PCR扩增
[0078] c-kit基因突变的扩增引物以及检测探针：
[0079] C11引物组合共7种，每个突变位点的引物为除开正常碱基序列外的三种碱基(如： 471位点正常人为T，则引物最后一个碱基分别为A，G，C)，X则代表三种碱基。
[0080] 引物母液浓度均为lOOnM/ml。
[0081] C11A引物：
[0098] c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR体系 中加入lul即可。
[0101] 1)定量PCR体系配制：
[0103]按照如下表格加样入8个PCR管：
[0108] 3、结果判读：
[0109] 以外控信号为标准，其信号Ct值在15-25,表明上样DNA的量在允许范围以内。所有 实验样本的外控曲线均应该升起，否则重新提取DNA检测。读取待检孔(孔号1) Ct值，Ct值为 〇(或者无扩增曲线)或者大于29判读阴性，判定为无 C11突变;Ct值小于28判读该信号孔阳 性。28~29重复实验，若仍然在28~29判读C11弱阳性突变。
[0110] 其中，阳性、弱阳性:代表样品至少有一个位点突变。 以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
[0112] 实验例1本发明试剂盒以及方法的准确度检测和特异性检测
[0113] 1、待检样本
[0114] 选取已知突变类型为c-kit基因11号外显子突变的临床GIST石蜡组织样本各1例 (共计90例，涉及本发明引物能够检测的所有氨基酸;其中第547位氨基酸的突变类型测序 结果见图1)和已知野生型临床GIST石蜡组织样本1例，检测人类c-kit基因突变类型。
[0115] 2、检测方法
[0116]本发明方法:采用实施例1的试剂盒，按照实施例1的方法进行检测。
[0117]样本DNA提取方法:用Qiagen公司试剂盒提取：
[0118] 1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
[0119] 2)将石蜡包埋组织切成4μπι厚的薄片；
[0120] 3)迅速用灭菌小镊子取2-6枚装入DNase/RNase Free ΕΡ管中（每张摊开面积500 (最大)mm2,即边长1.6cm的正方形大小；
[0121] 4)加入800μ1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
[0122] 5)加入800μ1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
[0123] 6)弃二甲苯，加入800μ1无水乙醇，最大转数离心3分钟；
[0124] 7)弃无水乙醇，挥干样品；
[0125] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C -小时以上，直至清亮；
[0126] 9)90°C -小时；
[0127] 10)离心6000g lmin，取上清；（此步骤是防止沉淀物阻塞柱子）
[0128] 11)加入200μ1 AL，混匀，加入200μ1乙醇，再混匀；
[0129] 12)简单离心清洁管壁；
[0130] 13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g lmin，换新的收集管；
[0131] 14)加入500μ1 AWl，6000g 离心 lmin;换收集管；
[0132] 15)加入500μ1 AW2,6000g 离心 lmin，换收集管；
[0133] 16)全速离心3min，干燥柱子；
[0134] 17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA;加入20-30μ1 ATE，在室温保持lmin 以溶解DNA。全速离心lmin收集DNA。
[0135] 3、实验结果
[0136] 如果突变型样本信号Ct值在28以内，则表示样本出现了c-kit基因11号外显子检 测突变类型(本发明30个氨基酸的突变)中至少一种突变。
[0137] 本发明90例突变型样本信号Ct值均在28以内，其中第547位氨基酸突变样本测序 结果如图2所示。图2中，曲线1是突变型样本信号；曲线2是外控信号，曲线3是阴性对照(野 生型对照)信号，样本信号Ct值在28以内，表示该样本出现了c-kit基因11号外显子的第547 位氨基酸发生突变。
[0138] 实验结果说明，本发明方法和试剂盒的检测结果与已知检测结果比较:结果一致， 说明本发明方法和试剂盒可以准确c-kit基因11号外显子突变，准确性强；另外，阴性对照 样本Ct值大于30,为阴性，说明了本发明方法和试剂盒的特异性好。
[0139] 实验例2本发明试剂盒以及方法的灵敏度分析
[0140] 1、试验方法
[0141] 取含有人类c-kit基因11号外显子突变的DNA，定量至浓度为8ng/ul，进行等比稀 释，稀释后的浓度分别为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、lng/ul、0.5ng/ul
[0142] 用实施例1的试剂盒，按照实施例1的定量PCR扩增进行检测。
[0143] 2、实验结果
[0144] 如图3所示，本发明试剂盒可以检测到浓度为0.5ng/ul的低浓度样本，灵敏度高。
[0145] 综上，本发明提供的试剂盒可以准确检测人类C-Kit基因11号外显子突变，特异性 和灵敏度高，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。
【主权项】
1. 一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO. 1~275 所示的引物对和SEQ ID NO.276所示的探针。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.277~279所示引物对与SEQ ID NO.276所示的探针。3. 权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测人类c-kit基因11号外显子突变的试剂中的 用途。 4.SEQ ID N0.1~275所示引物对。 5 .SEQ ID NO.276所示的探针。6. -种检测人类c-kit基因11号外显子突变的方法，其特征在于:它包括如下步骤： (1) 提取样本DNA:取待检组织，提取其中的DNA; (2) 基因扩增:用权利要求1或2所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增； (3) 结果检测:对DNA扩增结果进行检测。
【文档编号】C12Q1/68GK105950758SQ201610440446
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】肖林, 叶丰, 陈卉娇
【申请人】四川大学华西医院