一种检测egfr基因外显子21l858r点突变的试剂盒和方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体为一种检测人表皮生长因子受体基因EGFR外显子21上L858R点突变的方法及试剂盒；以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条标记不同类型荧光的TaqMan探针对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型及其数量及比例。
【专利说明】—种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物学领域和核酸检测领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子21上L858R点突变的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因突变可以给医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。[0003]表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶区域发生突变，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率达到80%以上。由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。
[0004]EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18_24编码，其中外显子18_20编码N-Lobe，外显子21~24编码C_Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21 ;非小细胞肺癌EGFR突变90%以上发生为exonl9的缺失突变及exon21的L858R点突变。
[0005]人表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子21L858R发生突变的非小细胞肺癌患者，对该类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。外显子21上的L858R点突变通常是替代突变，2573位的T由G取代，导致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸(CTG — CGG)。因此EGFR外显子21L858R点突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
[0006]目前基因变异的检测技术主要有直接测序法(亦称Sanger测序法)和ARMS法。现分别简介于下:
[0007]Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应(PCR)。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP，ddGTP, ddCTP, ddTTP (4种双脱氧核糖核苷酸)荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长(一般需2 — 3天)且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%~20%以上的突变。
[0008]ARMS 法也称扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)、等位基因特性PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)等，即等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplif ication, ASA)建立于 1989 年,是 PCR 技术应用的发展。[0009]ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及下游3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游5’端引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增突变型DNA模板。
[0010]上述现有技术存在以下问题:
[0011]1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测。
[0012]2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。
[0013]3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。
[0014]目前的检测一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法，用于癌症患者，特别是肺癌患者的靶向用药指导、高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测等。
【发明内容】
[0015]本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的PCR扩增引物、TaqMan探针及试剂盒和检测方法。
[0016]数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于I个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
[0017]本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条不同的TaqMan探针(标记不同类型荧光)对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型。
[0018]本发明技术方案如下。
[0019]一种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的PCR引物，为反向引物和正向引物；正向引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.1~5)中的一种:
[0020]F1:5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
[0021] F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
[0022]F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
[0023]F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0024]F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，；
[0025]反向引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.6~10)中的一种:[0026]Rl:5，-CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，，
[0027]R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
[0028]R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
[0029]R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
[0030]R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0031]优选的，正向引物为SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列；反向引物为SEQ IDN0.6~10之一的核苷酸序列；
[0032]更优选的，PCR引物选自以下各组序列之一: [0033](I)正向 F1:5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3 ’，
[0034]反向Rl: 5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，，或者，
[0035](2 )正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0036]反向R2:5，-TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0037](3 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3 ’，
[0038]反向R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，或者，
[0039](4 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0040]反向R4:5，-TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0041 ](5 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3 ’，
[0042]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0043]一种EGFR基因外显子21L858R点突变的TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针(PM)，或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针(PM)以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针(PW);两者均为为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且所含的荧光基团的种类不同。
[0044]与突变型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQ IDN0.11~15)中的一种:
[0045]PMl:5，-TTGGCCCGCCCAA-3’，
[0046]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，
[0047]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，
[0048]PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
[0049]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3’ ；
[0050]优选的，所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ IDN0.11~15中的一种。
[0051]所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQID N0.16~20)中的一种:
[0052]PWl:5，-TTGGCCAGCCCAA-3’，
[0053]PW2:5，-TTGGGCTGGCCAA-3，，
[0054]PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0055]PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0056]PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’。
[0057]优选的，所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ IDN0.16~20中的一种。
[0058]TaqMan探针上的荧光基团选自FAM (6_羧基荧光素)、HEX (六氯_6_羧基荧光素)、Cy5 (美国 Life Technologies)、Cy3 (美国 Life Technologies)、VIC (美国 LifeTechnologies)，荧光猝灭基团选自TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)、BHQl (美国LifeTechnologies)、BHQ2 (美国 Life Technologies)或 MGB (美国 Life Technologies)。
[0059]上述的TaqMan探针和PCR引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子21上L858R点突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
[0060]一种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的试剂盒，含有以下物质中的至少一种:
[0061](I)前述的PCR引物;
[0062](2 )前述的 TaqMan 探针。
[0063]上述引物和探针是针对EGFR外显子21上L58R点突变设计优化的，这种试剂盒可基于数字PCR平台来检测EGFR外显子21上L858R点突变。
[0064]本发明检测EGFR外显子21上L858R点突变的方法，步骤包括:
[0065]1.将待测样品DNA模板、PCR引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；其中，所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下:
[0066]a.DNA 模板,含量为 0.25 ~Ing/ μ L,优选为 0.5ng/ μ L ；
[0067]b.PCR引物，包括正向弓丨物和反向引物，含量分别为500~700nM，优选为600nM ；
[0068]c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200~400nM，优选为300nM ;或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200~400nM，优选为300nM。
[0069]其中PCR引物包括正向引物和反向引物，正向引物含有以下核苷酸序列(SEQ IDN0.1 ~5)之一:
[0070]Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
[0071 ] F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
[0072]F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
[0073]F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0074]F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，。
[0075]反向PCR引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.5~10)之一:
[0076]Rl:5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，，
[0077]R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
[0078]R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
[0079]R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
[0080]R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0081]优选的，正向引物选自SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列，反向引物选自SEQ IDN0.5~10之一的核苷酸序列；
[0082]更优选的，PCR引物选自以下各组序列之一:
[0083](I)正向 F1:5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3 ’，[0084]反向Rl: 5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3 ’，或者，
[0085](2 )正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0086]反向R2:5，-TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0087](3 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3 ’，
[0088]反向R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，或者，
[0089](4 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0090]反向R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0091](5 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3 ’，
[0092]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0093]Taqman探针包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针(PM)，或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针(PM)以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针(PW);两者均为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，而且所含荧光基团的类型不同。
[0094]与突变型DNA模板结合的Taqman探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQ IDN0.11 ~15)之一:
[0095]PMl:5，-TTGGCCCGCCCAA-3’，
[0096]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，
[0097]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，
[0098]PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
[0099]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3’。
[0100]其中与野生型DNA模板结合的Taqman探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.16 ~20)之一:
[0101]PWl: 5，-TTGGCCAGCCCAA-3 ’，
[0102]PW2:5 ’ -TTGGGCTGGCCAA-3，，
[0103]PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0104]PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0105]PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’。
[0106]TaqMan探针上的荧光基团选自FAM (6_羧基荧光素)、HEX (六氯_6_羧基荧光素)、Cy5 (美国 Life Technologies)、Cy3 (美国 Life Technologies)、VIC (美国 LifeTechnologies)，荧光猝灭基团选自TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)、BHQl (美国LifeTechnologies)、BHQ2 (美国 Life Technologies)或 MGB (美国 Life Technologies)。
[0107]优选的，与突变型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID N0.11~15中的一种，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针核苷酸部分选自SEQ ID N0.16~20中的一种。
[0108]2.数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应，条件为:93~97°C预变性3~15分钟；93~97°C变性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共进行20~60个循环，2~10°C终止反应；
[0109]优选的PCR扩增条件为，93.5~95°C预变性3~6分钟；93.5~95°C变性8~15秒，64.5~66°C 退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共进行30~35个循环，6~10°C终止反应。[0110]更优选的PCR扩增条件为，94°C预变性5分钟；94°C变性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共进行32个循环，10°C终止反应。
[0111]优选的，数字PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000~20000个微反应液滴。
[0112]3.PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光类型判断待测样品中是否含有EGFR基因外显子21L858R点突变的DNA模板，还可确定其中EGFR基因外显子21L858R点突变的DNA模板的数量和含量。
[0113]可用QuantaSoft (Biorad)软件进行数据分析,计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。
[0114]通过上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子21上L858R点突变。
[0115]与现有技术比较，本发明的优点在于:
[0116]1.结果判读方式:以前的技术方法结果的判读需要人工参与，肉眼依据相关图形作出最后的判断，这种判读的方式严重依赖经验，速度慢且很容易产生假阳性和假阴性的判读结果。我们的技术方式给出的是数据信息，可以借助软件完全自动化的进行结果判读，从而加快了数据分析的速度，也减少了产生假阴性和假阳性判读的可能。
[0117]2.结果描述的方式:以前的技术方式对基因变异的描述是定性的方式，也就是说，只是描述某个特异的基因变异是否存在于检测样本。本技术方法对基因变异的描述是绝对定量的方式，可以给出样本所携带某种特异基因变异DNA的绝对数量和比例。而且准确率高，即使在突变样本含量极低的情况下，定量分析的误差也很小。
[0118]3.检测灵敏度(数值越小灵敏度越好):以前技术方法的灵敏度一般在1%— 50%之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，能达到1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。
【专利附图】
【附图说明】
[0119]图1为实施例1中，不同含量突变样本的荧光检测结果。
【具体实施方式】
[0120]以下实施例是对本发明的更详细说明，而不是对本发明范围的限定。
[0121]所用基因序列的来源为NCBI (美国国立生物技术信息中心):
[0122](I)准备样品:含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子21上L858R点突变的突变阳性DNA与野生型DNA混合样本(其中突变DNA的与野生型DNA的含量比分别为1/1、1/100、1/1000、1/2500)。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。其中，突变DNA模板来源于携带EGFR外显子21上L858R点替换突变的细胞系(经PCR测序鉴定)，其中突变的位点在EGFR外显子21上c.2573位(T变为G)。
[0123](2)室温融解PCR引物及对应TaqMan探针。
[0124]正向和反向PCR引物的序列为:
[0125]Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，
[0126]Rl:5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，
[0127]TaqMan探针的序列为:[0128]与野生型DNA结合的TaqMan探针PWl上连接的荧光基团和猝灭基团为VIC和MGB，其核苷酸部分序列为:5’ -TTGGCCAGCCCAA-3’。
[0129]与突变型DNA结合的TaqMan探针PMl上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB，其核苷酸部分序列为:PM15’ -TTGGCCCGCCCAA-3’。
[0130](3)按照以下配比制备PCR反应液:2X数字PCR预混液(Biorad，#186-3022)与正向及反向PCR引物、与野生型DNA模板结合的TaqMan探针、与突变型DNA模板结合的TaqMan探针及与待检测DNA (IOng)混合，用蒸馏水补足至终体积为20 μ L，配制成数字PCR混合液。其中正向及反向PCR引物含量分别为600ηΜ，与野生型DNA模板结合的TaqMan探针以及与突变型DNA模板结合的TaqMan探针分别为300ηΜ。
[0131](4)配制好的20 μ L数字PCR混合液加入到8_道的液滴制作板内，然后加入60 μ L液滴制作油到制作板用于制备PCR微反应液滴(QX200微滴发生器)。
[0132](5)将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000~20000个。
[0133](6)将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应: [0134]94°C预变性5分钟；94°C变性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共进行32个循环，10°C终止反应。
[0135](7)PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪(QX200微滴荧光信号收集系统)中进行信号收集，检测FAM和VIC的荧光信号。用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析结果如图1。可进行定量分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对总DNA的比例。
[0136]突变体与野生型的含量不同的样品检测结果中，突变阳性信号数(FAM)与总信号数(FAM和VIC)如下:
[0137]1/1 样品:5570/11274，计算值突变 / 野生=0.976/1，误差 2.4%
[0138]1/100 样品 87/9012，计算值突变 / 野生=0.00975/1，误差 2.5%
[0139]1/1000 样品:22/19782，计算值突变/野生=0.0011/1，误差 10%
[0140]1/2500 样品:5/12582，计算值突变 / 野生=0.000397/1，误差 0.1%。
[0141]以上述方法，可以检测位于c.2573的EGFR外显子21上L858R点突变，检出限达到1/2500。定量分析的结果显示，误差一般在0.1%~3%，不超过10%。
[0142]使用以下各组之一的PCR引物时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，而且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1~1/100时，定量检测误差一般低于5%:
[0143](I)正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0144]反向R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0145](2 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
[0146]反向R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，或者，
[0147](3 )正向 F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0148]反向R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0149](4 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，，
[0150]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。[0151]使用的TaqMan探针核苷酸部分改为以下各组序列之一时，按照上述步骤检测，结果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出，并且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1~1/100时，定量分析的误差一般在0.1%~5%。
[0152](I) PW2:5，-TTGGGCTGGCCAA-3，，
[0153]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，或者，
[0154](2 ) PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0155]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，或者，
[0156](3 ) PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0157]PM4:5 ’ -AGTTTGGCCCGCC-3，，或者，
[0158](4 ) PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’，
[0159]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3，。
[0160]对照例
[0161]—、使用不同的使用PCR引物、TaqMan探针序列
[0162]1、按照实施例1的方法，区别在于使用不同的PCR引物，是按照荧光定量PCR技术设计的正反向引物。·
[0163]正向和反向PCR引物的序列为:
[0164]F1，:5， -AGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’
[0165]Rl:’ 5 ’ -CTTACTTTGCCTCCTTCTGCATG-3，
[0166]在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约三分之一样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
[0167]2、使用不同的TaqMan探针(按荧光定量PCR技术设计)。
[0168]TaqMan探针的核苷酸部分序列为:
[0169]与野生型DNA 模板结合的 PW1’: 5 ’ -CCCAGCAGTTTGGCCAG-3 ’
[0170]与突变型DNA 模板结合的 PM1’: 5’ -CCCAGCAGTTTGGCCCG-3’
[0171]在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约三分之一样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。突变样本含量为1/100的样品进行定量检测，误差为15%以上。
[0172]二、使用不同浓度的PCR引物和探针
[0173]1、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中PCR正向和反向引物的浓度分别为60nM。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。
[0174]2、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中PCR正向和反向引物的浓度分别为60nM，两种TaqMan探针的浓度分别为60nM，仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。
[0175]三、使用荧光定量PCR的方法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。
【权利要求】
1.一种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的PCR引物，其特征在于，为反向引物和正向引物； 正向引物含有以下核苷酸序列之一:
Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
F2:5 ’ -AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
F3:5 ’ -CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，， F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，； 反向引物含有以下核苷酸序列之一:
Rl: 5’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’，
R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
R3:5 ’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
2.权利要求1所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的PCR引物，其特征在于，正向引物选自以下核苷酸序列中的一种:
Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
F2:5 ’ -AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
F3:5 ’ -CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，， F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，； 反向引物选自以下核苷酸序列中的一种:
Rl: 5’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’，
R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
R3:5 ’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
3.权利要求1所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的PCR引物，其特征在于，正向和反向引物选自以下各组核苷酸序列之一: (I)正向 Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，， 反向 Rl: 5’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’，或者，
(2 )正向 F2:5 ’ -AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，， 反向 R2:5’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3’，或者，
(3 )正向 F3:5 ’ -CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，， 反向 R3:5’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3’，或者， (4 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，， 反向 R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
(5 )正向 F5:5 ’ -GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，， 反向 R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
4.检测EGFR基因外显子21L858R点突变的TaqMan探针，其特征在于，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，或者包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针； 所述与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，且两者所含的荧光基团不同； 与突变型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种: PMl:5 ’ -TTGGCCCGCCCAA-3，，
PM2:5 ’ -TTTGGCCCGCCCA-3，，
PM3:5 ’ -GTTTGGCCCGCCC-3，，
PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3，； 所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种:
PWl:5 ’ -TTGGCCAGCCCAA-3，,
PW2:5 ’ -TTGGGCTGGCCAA-3，，
PW3:5 ’ -TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
PW4:5> -TGGGCTGGCCAAA-3，,
PW5:5 ’ -GGGCTGGCCAAACTG-3，。
5.权利要求4所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的TaqMan探针，其特征在于，荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、Cy5、Cy3或VIC，猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQl、BHQ2或MGB。
6.权利要求4所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的TaqMan探针，其特征在于，所述与突变型野生型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分选自以下核苷酸序列中的一种:
PMl:5 ’ -TTGGCCCGCCCAA-3，，
PM2:5 ’ -TTTGGCCCGCCCA-3，，
PM3:5 ’ -GTTTGGCCCGCCC-3，，
PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3，； 所述与野生型DNA模板结合的TaqMan探针的核苷酸部分选自以下核苷酸序列中的一种:
PWl:5 ’ -TTGGCCAGCCCAA-3，,
PW2:5 ’ -TTGGGCTGGCCAA-3，，
PW3:5 ’ -TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
PW4:5> -TGGGCTGGCCAAA-3，,
PW5:5 ’ -GGGCTGGCCAAACTG-3，。
7.一种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质中的至少一种: (I)权利要求1、2或3任一项所述的PCR引物；(2)权利要求4、5或6任一项所述的TaqMan探针。
8.一种检测EGFR基因外显子21L858R点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)数字PCR混合液制备:将待测的DNA模板、权利要求1~3任一项所述PCR引物、权利要求4~6任一项的TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；其中的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下: a.DNA模板,含量为0.25~Ing/ μ L ； b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为500~700nM; c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为200~400nM ;或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为200~400nM ； (2)用数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应； PCR扩增条件为:93~97°C预变性3~15分钟；93~97°C变性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共进行20~60个循环，2~10°C终止反应； (3)信号收集与结果判断:对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EG FR基因外显子21L858R点突变的DNA模板及其数量和含量。
9.权利要求8所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的方法，其特征在于，数字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探针的含量如下: a.DNA模板,含量为0.5ng/ μ L ； b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分别为600nM ； c.TaqMan探针，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针，含量为300nM ;或者，包括与突变型DNA模板结合的TaqMan探针以及与野生型DNA模板结合的TaqMan探针，含量分别为300nM。
10.权利要求8所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为:93.5~95°C预变性3~6分钟；93.5~95°C变性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共进行30~35个循环，6~10°C终止反应。
11.权利要求8所述检测EGFR基因外显子21L858R点突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟；94°C变性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共进行32个循环，10°C终止反应。
【文档编号】C12Q1/68GK103740843SQ201410040845
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】王贻锘 申请人:上海涌泰生物医药科技有限公司