一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物的制作方法

一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，包括以下步骤：利用小麦麸皮培养基培养类芽孢杆菌CGMCC?No.8333，15℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。所得提取物的凝乳酶活力最高达到6469.72±280.65SU/mL，而且其蛋白酶水解活力仅为10.54±0.65U/mL，两者之比高达613.82。利用该发酵液提取物可使液态奶在短时间内发生凝乳，而且对酪蛋白的非特异水解低。本发明公开的具有凝乳酶活性的发酵液提取物制备干酪的得率很高，该发酵液提取物在原制干酪生产加工产业中具有广阔应用前景。
【专利说明】一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物和应用。
【背景技术】
[0002]凝乳是生产原制干酪的关键步骤，凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用，并直接关系到干酪的品质和得率。传统干酪加工中所使用的凝乳酶(rennet)来源于未断奶小牛的第四胃(皱胃)，主要由凝乳酶(chymosin)和胃蛋白酶(pepsin)组成。商业化的小牛皱胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50~95%。凝乳酶介导凝乳反应涉及两个步骤:(1)酶解酪蛋白:凝乳酶(Chymosin，E.C.3.4.23.4)对κ-CN具有高度特异性，主要水解κ-CN中的Pheltl5-Metltl6的肽键，生成由106-109残基氨基酸组成的κ -酪蛋白巨肽(κ-caseinmacropeptide)和由1_105残基氨基酸组成的副κ -酪蛋白(para- κ -casein),凝乳酶也能够水解a sl_CN、a s2-CN、β -CN ; (2)当足够的κ -CN被水解时，副κ -酪蛋白发生聚集形成三维网状凝胶，Ca2+促发酪蛋白胶束聚集，进而引起酪蛋白胶束失稳并形成干酪凝块。
[0003]干酪加工中使用的凝乳酶的早在50多年前凝乳酶的需求已超过其产量，与此同时自1961年以来，世界干酪产量大约增加了 3.5倍，小牛皱胃凝乳酶供应量确呈下降趋势，目前，世界小牛皱胃凝乳酶的仅能满足世界干酪产量所需凝乳酶的20~30%。小牛皱胃凝乳酶的供需矛盾和价格高昂、宗教(伊斯兰教和犹太教)、饮食(素食主义)以及食品法规等因素，使得寻求其替代物成为乳品领域科学研究的热点之一，寻求小牛皱胃凝乳酶替代物的研究主要动物、植物、基因重组以及微生物四个方面开展。动物和植物来源的凝乳酶主要用于特定种类的干酪，其来源和产量同样受到限制；利用基因重组技术制备的凝乳酶具有成分单一等优点，但是，一些国家如法国、德国和荷兰禁止使用重组凝乳酶。
[0004]微生物能够产生许多种酶类，其中绝大部分`分泌量很小并涉及细胞代谢过程，胞外酶能够消化不溶的纤维素、淀粉和蛋白质大分子物质，并转移至胞内作为细胞生长的营养物质。许多微生物，尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性质，与植物和动物来源凝乳酶(MCEs)相比较，微生物来源的凝乳酶(MCEs)具有生产成本低、具有更加广泛的生化多样性以及基因改造方法简便等优点。微生物来源凝乳酶可分为两类:(a)来源于曲霉(Aspergillus spp.)和根霉菌(Rhizopus spp.)的类胃蛋白酶(pepsin-like) ； (b)来源于毛霉菌(Mucorspp.)、根霉菌(Rhizomucorspp.)和板栗疫病菌(Endothiaparasitica)的类凝乳酶(rennin-like)。目前，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)和板栗疫病菌(Endotiaparasitica)三种来源的凝乳酶已用于大规模商业化生产中，已占到了全球蛋白酶市场的33%。然而，近年来微生物凝乳酶研究主要集中在芽胞杆菌属(Bacillus)，所得蛋白酶通常具有较高的蛋白酶水解活力，并具有耐热性较强、不易灭活，导致蛋白质降解并转化为乳清，因此，对干酪得率具有负面作用，只有部分适合于干酪生产。因此尽管部分微生物凝乳酶已产业化，筛选新型产凝乳酶的微生物菌种仍是该领域的重要研究工作。
【发明内容】

[0005]因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前存在的凝乳酶来源和产量严重不足的技术问题，提供了一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物和应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是:一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，其所述制备方法包括以下步骤:利用小麦麸皮培养基培养类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333,15°C~4CTC,震荡培养 18 ~120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。
[0007]本发明所述小麦麸皮培养基包括小麦麸皮和水。其中所述的小麦麸皮为本领域常规的小麦麸皮，所述小麦麸皮的来源较佳地包括:山东、河南和江苏，优选的来源为山东。
[0008]本发明所述小麦麸皮培养基中小麦麸皮的含量较佳地为1%~14%，更佳地为1%~10%，最佳地为3%，所述百分比为质量百分比。本发明所述菌株类芽孢杆菌CGMCC N0.8333的接种量较佳地为I~9%，更佳地为3%~7%，最佳地为5%，所述百分比为体积百分比。其中所述培养温度较佳地为20°C~40°C，更佳地为25°C~35°C，最佳地为30°C ;所述震荡速度较佳地为140~300r/min，更佳地为200~300r/min，最佳地为300r/min，所述培养的时间较佳地为18~120小时，更佳地为20~48小时，最佳地为20小时，其中所述离心的速度较佳地为9000~14000r/min。
[0009]本发明所述小麦麸皮培养基包含的营养成分较佳地为:蛋白质:18.6%,脂肪:
6.20%，总碳水化合物:63.9%，水分:7.89%，灰分:3.38%，所述百分比为质量百分比。
[0010]本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法较佳地还包括菌种活化的步骤。所述菌种活化步骤包括:将本发明所述类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种在TYC培养基中，25°C~35°C培养18~48·小时作为种子；将活化好的菌种按I~9%的接种量接种于盛有1%~14%的小麦麸皮培养基的250mL锥形瓶中震荡培养，250mL锥形瓶装液量为20mL~IOOmL,摇床转速为140~300r/min，培养温度为20°C~40°C，培养时间为18~120小时，其中所述百分比为质量百分比。
[0011]其中所述菌株类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种量更佳地为I~5%，最佳地为3%，所述百分比为体积百分比；小麦麸皮培养基中的小麦麸皮含量较佳地为1%~14%，更佳地为1%~10%，最佳地为3%，所述百分比为质量百分比；250mL锥形瓶中装液量较佳地为2OmL~IOOmL,更佳地为25mL~75mL，最佳地为30mL ;震荡培养的震荡速度较佳地为140~300r/min，最佳地为300r/min ;培养温度较佳地为25°C~35°C，最佳地为30°C ;活化时间较佳地为18~48小时，更佳地为18~24小时，最佳地为18小时。
[0012]本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法较佳地还包括将所得上清液经过精制干燥的步骤，所述精制干燥步骤为本领域常规的真空冷冻干燥步骤，所述真空冷冻干燥的温度较佳地为_44°C~_40°C，优选地为_40°C。
[0013]本发明所述TYC培养基为本领域常规的TYC培养基，所述TYC培养基的配方及制备方法较佳地为:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g，蔗糖50g，酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g，乙酸钠20g, Na2SO40.lg，NaCllg，Na2HPO4.12H202g，NaHC032g，琼月旨 15_20g，加水至 lL,pH7.3,121°C灭菌15分钟即得，上述原料的制备方法均为本领域常规制备方法，或者通过市售可得。
[0014]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是:如本发明所述制备方法所得的具有凝乳酶活性的发酵液提取物。本发明制备所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物的凝乳酶活力比普通的微生物来源发酵液提取物的凝乳酶活力更高。
[0015]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为:本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备凝乳酶中的应用。
[0016]本发明所述凝乳酶的制备方法为本领域常规的制备方法，只要以本发明所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物为原料进行制备即得。
[0017]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四为:本发明所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备发酵乳制品中的应用。
[0018]本发明所述发酵乳制品为本领域常规发酵乳制品，较佳地包括发酵乳，乳酸菌饮料，酸乳粉，发酵乳酪，更佳地为发酵乳酪，优选地为干酪。
[0019]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0020]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0021]本发明的积极进步效果在于:本发明所得具有凝乳酶活性的发酵液提取物的凝乳酶活力高达6469.72 ± 280.65SU/mL,并且所得发酵液提取物的蛋白酶水解活力仅为10.54±0.65~1^，二者之比高达613.82。本发明提供的具有凝乳酶活性的发酵液提取物能够使液态奶在短时间内发生凝乳，并且所得发酵液提取物对酪蛋白的非特异水解活性极低，因此所述具有凝乳酶活性的发酵液提取物在原制干酪生产加工方面具有广阔的应用前
旦
-5^ O`[0022]生物材料保藏信息
[0023]本发明的类芽孢杆菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。该菌株的保藏编号为=CGMCC N0.8333。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，培养物名称为BD3526。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]以下结合【专利附图】

【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0025]图1为本发明所述类芽孢杆菌CGMCC N0.8333在TYC平板上的菌落图。
[0026]图2显示本发明类芽孢杆菌CGMCC N0.8333的16S rRNA系统发育进化树。
[0027]图3为本发明所述类芽孢杆菌CGMCC N0.8333麸皮发酵上清凝乳形态图。
【具体实施方式】
[0028]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0029]Paenibacillus hunanensis FeL05T (ACCC10718T=CGMCC N0.1.8907τ)与Paenibacillus polymyxa ATCC842T (CGMCC N0.1.4261T)购买自自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101)。
[0030]实施例1菌株BD3526的初筛[0031]从西藏自治区当雄县采集牦牛奶，以无菌方式取1ml，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上(所述TYC培养基的组分为:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g,鹿糖50g，酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g,乙酸钠20g,Na2SO40.lg,NaCllg,Na2HPO4.12H202g, NaHC032g，琼脂15_20g，加水至1L，pH7.3，将上述组分溶解在蒸馏水中，121°C灭菌15分钟即得)，30°C培养24-48小时。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到纯化的菌落。
[0032]实施例2菌株BD3526的获得及其特征
[0033]Biolog微生物自动检测仪(生产厂商:Biolog公司)鉴定实验:
[0034]Biolog微生物自动检测仪(生产厂商=Biolog公司)鉴定实验,是Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，筛选95种不同碳源或其他化学物质，配合显色物质，固定于96孔板上(Al孔为阴性对照)。接种菌悬液培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行呼吸代谢过程中产生的化学还原物质欲显色物质发生反应导致的吸光度以及由于微生物生长造成的浊度，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得到最终鉴定结果。
[0035]I)取如上所述实施例1中的单菌落多个，分别接种到液体TYC中，30°C培养24h。
[0036]2)在10000r/min下离心20min,弃去上清液,加ImL生理盐水,在振荡器上振动5min使之混匀；再于10000r/min下离心20min,重复2次,除去其中的碳源；弃去上清液,加ImL生理盐水,在振荡器上振动5min使之混匀，于2000r/min下离心lmin。
[0037]3)取上清液倒入装有20mL已灭菌生理盐水(NaCl，0.85%)的试管中，并使其OD59tl 维持在 0.13 ±0.02。
[0038]4)将如上所述稀 释液加入Biolog ECO微平板中(150 μ L /孔)，然后在20°C下培养，每隔12h用Biolog细菌自动读数仪读取数据，连续测定2d。结果如表1所示。
[0039]表1菌株BD3526的Biolog鉴定结果
[0040]
【权利要求】
1.一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤:利用小麦麸皮培养基培养类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333，15°C~40°C，震荡培养18~120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小麦麸皮培养基的组分包括小麦麸皮和水，其中小麦麸皮的含量为1%~14%，所述百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小麦麸皮培养基中小麦麸皮的质量百分比含量为1%~10%，所述震荡培养的震荡速度为140r/min~300r/min，震荡培养的时间为20小时~48小时。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为(TC~4°C，离心速度为 9000r/min ~14000r/min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括菌种活化步骤，所述菌种活化步骤为:将所述类芽孢杆菌CGMCC N0.8333接种在TYC培养基中，25°C~35°C活化培养18~48小时作为种子使用；将活化好的菌种按体积百分比I~9%的接种量，接种于包含质量百分比为1%~14%小麦麸皮的小麦麸皮培养基中震荡培养。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，活化培养的时间为18小时~48小时，所述震荡培养的震荡速度为140~300r/min，震荡培养的温度为25°C~35°C ;震荡培养的时间为18小时~120小时。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所得上清液经过精制干燥的步骤，所述精制干燥步骤为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的温度为-44°C~-40°C。`
8.如权利要求1~7任一项所述制备方法所得的具有凝乳酶活性的发酵液提取物。
9.如权利要求8所述的具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备凝乳酶中的应用。
10.如权利要求8所述的具有凝乳酶活性的发酵液提取物在制备发酵乳制品中的应用，其中所述发酵乳制品为干酪。
【文档编号】C12N1/20GK103865842SQ201410040762
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】杭锋, 郭本恒, 刘振民, 陈卫, 王钦博, 宋馨, 吴正钧, 张灏, 朱军伟 申请人:光明乳业股份有限公司