鼠灰链霉菌amp脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法
【专利摘要】本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLAC1构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。本发明首次在乳酸克鲁维酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，可应用于食品、医药等领域。
【专利说明】鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及AMP脱氨酶基因的真核表达，具体涉及一种鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法及其表达产物的应用，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]AMP脱氨酶,英文名为AMP deaminase,简写为AMPD,是一种氨基水解酶,其可催化AMP使其脱去氨基生成肌苷酸(IMP)和NH3，IMP在食品以及制药等领域中有重要应用。另外，AMP脱氨酶是嘌呤核苷酸代谢循环中的三种主要酶类之一，对于维持机体免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脱氨酶是工业生产中一种重要的酶。
[0003]AMP脱氨酶广泛存在于各种生物体内。其最早由鼠骨骼肌制备，随后又由人红血细胞制备，目前工业化生产中通常由酵母、霉菌等微生物发酵产AMP脱氨酶，但是在酶的提取纯化、酶活性以及稳定性等方面存在诸多问题。因此，利用DNA重组技术，将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。现在国内关于AMP脱氨酶基因重组表达的研究从未报道过，国外关于该酶的重组表达的研究较少，仅在申请号为CN200580013789.3的专利“放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用”( 申请人::天野酶株式会社)中报道过一次。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的不足，本 申请人:经过研究改进，提供一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。本发明首次在乳酸克鲁维酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，是以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLACl构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用PKLACl通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
[0007]具体的，所述方法步骤如下:
[0008]( I)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
[0009]以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物；
[0010](2)重组表达载体的构建
[0011]将表达载体pKLACl和步骤(1)所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
[0012](3)线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选
[0013]提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyceslactis GG799，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLACl通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子；
[0014](4)重组酶在GG799中的表达
[0015]将步骤(3)筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2%的接种量接种至YPD培养基，于30°C、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
[0016]优选地，步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)MCCCN0.1A01641。
[0017]本发明还提供了上述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
[0018]本发明的有益技术效果在于:
[0019]本发明首次以鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因组为模板，通过重组载体pKLACl-AMPD的构建，转化，阳性克隆转化子和多拷贝转化子的筛选，液体发酵等步骤及其工艺条件参数的精心分析和优化，在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG79)中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶。 实验结果显示，本发明制备得到的重组AMP脱氨酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础，可应用于食品、医药等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为实施例2中重组表达载体pKLACl-AMPD酶切验证电泳图。
[0021]图2为实施例4中Kluyveromyces lactis GG79重组菌不同发酵时间的酶活变化趋势图。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。
[0023]以下实施例所涉及实验材料如下:
[0024]菌株:鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，保藏编号 MCCC N0.1A01641，以下简称鼠灰链霉菌 MCCC1A01641 ；E.coli JM109购自大连宝生物工程有限公司；Kluyveromyces lactisGG799、pKLACl均购自New EnglandBiolabs 公司。
[0025]所涉及其他试剂及试剂盒均为国产或进口商品。
[0026]实施例1鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
[0027]以鼠灰链霉菌MCCC1A01641基因组为模板，设计引物对AMPDF3/AMPDR3特异性扩增鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因，在其两端分别加入XhoI酶切位点和BglII酶切位点，引物对AMPDF3/AMPDR3 序列如下:AMPDF3: B，-GTTCTCGAG AAAAGA GCGCCGCCGCCCCGGCAG-3，(SEQID NO:1) ；AMPDR3:5，-GAAGATCTTCACCCCCGGGCGTGCGCCC-3> (SEQ ID NO:2)；
[0028]纯化回收PCR产物。[0029]实施例2重组表达载体pKLACl-AMPD的构建
[0030]将载体pKLACl和实施例1所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，切胶回收纯化，酶切产物于16°C连接过夜，连接产物转化E.coli JM109，提取pKLACl-AMPD-JM109菌株质粒，用XhoI和BglII双酶切验证，筛选出PKLAC1-AMPD-JM109阳性菌株。重组表达载体pKLACl-AMPD酶切验证电泳图如图1所示。
[0031]实施例3线性化质粒pKLACl-AMPD对GG799的电转化以及转化子的筛选
[0032]提取实施例2所得pKLACl-AMPD-JM109阳性菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyces lactis GG799,涂布YCB平板,于3~5天后挑取单菌落检测,通过蜗牛酶法提取重组子染色体基因组，使用特异性引物AMPDF3/AMPDR3进行PCR验证，从而得到阳性克隆转化子；然后利用PKLACl载体自带的通用引物进行PCR以筛选出多拷贝转化子，所述通用引物序列如表1所示:
[0033]表lpKLACl载体通用弓丨物序列
[0034]
【权利要求】
1.鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于:以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLACl构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用PKLACl通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
2.根据权利要求1所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下: (1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆 以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物； (2)重组表达载体的构建 将表达载体PKLACl和步骤(1)所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株； (3)线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选 提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyceslactis GG799， 使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLACl通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子； (4)重组酶在GG799中的表达 将步骤(3)筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2%的接种量接种至YPD培养基，于3(TC、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
3.根据权利要求2所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于:步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus) MCCCN0.1A01641。
4.权利要求1~3任一项所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103757035SQ201410040528
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】张梁, 石贵阳, 方炜, 丁重阳, 顾正华 申请人:江南大学