一种检测维生素c中脱氢维生素c的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测维生素C中脱氢维生素C的方法，属于分析化学领域；该方法采用液相色谱、HILIC亲合色谱柱，乙腈??异丙醇?水为流动相A相、乙腈?水为流动相B相，梯度洗脱进行分析，本技术方案可以迅速、准确的分析出脱氢维生素C的含量，该方法的定量限可达0.38μg/ml，检测限为0.11μg/ml，同时该方法的平均回收率为100.5％，在0.38μg/ml～77.75μg/ml范围内，脱氢VC浓度与峰面积呈良好的线性关系；本发明公开的液相方法也可以应用于维生素C药品、注射用复方维生素(3)及复方维生素(13)注射液稳定性、降解等维生素质量研究。
【专利说明】
一种检测维生素 C中脱氢维生素 C的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测维生素 C中脱氢维生素 C的方法，特别涉及一种利用HILIC亲 合柱测定脱氢维生素 C的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素 C是细胞氧化-还原反应中的催化剂，人体自身不能合成，必须从食物中摄 取;食品中加入维生素 C兼有营养强化和防变质、保鲜等多重作用;其结构式为：
[0003]
[0004] 分子式为C6H8〇6,分子量为176.13
[0005] 维生素 C不稳定，极易被氧化分解，从而失去维生素 C的功效。当在有氧条件下，维 生素(：被氧化为脱氢抗坏血酸（脱氢维生素〇，然后生成2,3-二氧代-1^-古洛糖酸（2,3-Dike-to-L-gulonic acid)，进一步降解生成糠醛和羟基糠醛;脱氢抗坏血酸的生成标志着 维生素 C已失去了活性，所以测定脱氢抗坏血酸具有重要的意义，其结构式为：
[0006]
[0007] 分子式为C6H6〇6,分子量为174.11
[0008] 目前没有关于维生素 C中脱氢维生素 C检测分析方法的专利文献，而在非专利文献 中，张会轻等人研究了一种维生素 C中降解产物脱氢VC的HPLC测定方法(医药化工，2011.6 第34卷第6期），该文献中公开了采用高效液相色谱法，用氨基柱（250X4.6mm)对VC及脱氢 VC进行分离测定，流动相乙腈和三氟乙酸的比例为85:15,采用蒸发光检测器，柱温为100 °C;最后检测脱氢VC和VC的保留时间分别为3.93min和4.45min，此文献中公开的脱氢VC的 检测范围为0.5-1.5mg/ml，平均回收率为101.2%;文献抗坏血酸降解产物的色谱分析(袁 军、华西药学杂志，2001.16(4) :305-306)中公开了采用光二极管阵列检测器、硅胶柱，以 0.02mo 1/L的KH2PO4-乙腈（1:3)为流动相，流速0.5ml/min，测试VC和脱氢VC的混合液，VC和 脱氢VC的混合液中两峰保留时间分别为7.35min和5.46min;同时本文献中公开了利用硅胶 G板薄层板的方法测出的去氢抗坏血酸的最低检出限为0.8ug。
[0009] 由于维生素 C极易被氧化分解失去维生素 C的功效，而以上检测方法中脱氢维生素 C的最低检测限较高，灵敏度不高，并且方法的回收率数值超过了 101 %，另外氨基柱和硅胶 柱的耐用性不高，蒸发光检测器普及性差、灵敏度低等问题，急需要一种灵敏度高、检测限 低、回收率准确的分析方法来检测维生素 C中脱氢维生素 C的方法。
【发明内容】
[0010] 本发明为解决以上问题提供一种简单、快速分离分析维生素 C中的脱氢维生素 C的 高效液相色谱法，从而实现对维生素 C的质量控制。
[0011] 本发明的技术方案如下：
[0012] -种检测维生素 C中脱氢维生素 C的方法，该方法采用高效液相色谱仪测定，其色 谱条件为：
[0013] 色谱柱:HILIC亲合色谱柱；
[0014] 流速:0.8-1.2ml/min;
[0015] 柱温：30-40 °C;
[0016] 紫外检测器检测波长：220-230nm;
[0017] 进样量：1〇-3〇μ1;
[0018] 流动相:Α相：乙腈一异丙醇-水；
[0019] B相：乙腈-水；
[0020] 流动相A、B按梯度程序进行。
[0021] 上述HILIC亲合色谱柱规格为:250mm X 4 · 6mm，5μπι。
[0022] 其中，流动相:Α相中乙腈一异丙醇-水的体积比为:85~89:8~12:3;Β相中乙腈- 水的体积比为65~75:25~35;
[0023] 流动相:Α相乙腈一异丙醇-水的体积比优选为:86~87:9~11:3; Β相乙腈-水的体 积比优选为：68~73:28~32;
[0024]优选的进样温度为35°C;
[0025] 优选的进样量为20μ1。
[0026] 进样梯度程序为：
[0027]
[0028]
[0029] 该方法可用于检测注射用复方维生素(3)及复方维生素（13)注射液中脱氢维生素 C的含量，以便用于研究注射剂的稳定性、降解性等性能。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 1)通过采用紫外检测器及HILIC亲合色谱柱的技术，解决了蒸发光检测器灵敏度 低、普及性差，以及氨基柱、硅胶柱等耐用性差的问题，得到了灵敏度高、重复性好、可以准 确定量检测维生素 C中脱氢维生素 C的分析方法；
[0032] 2)经过检测，本发明的定量限为0.38μg/ml，检测限为O.lUig/ml;表明该法检测灵 敏度较高，满足VC中微量脱氢VC的定性和定量检测；
[0033] 3)在已知浓度的样品中加入脱氢VC标准品，计算回收率，其平均回收率为 100.5 %，相对标准偏差为1.01 %，达到分析要求；
[0034] 4)本发明在0.38μg/ml~77.75μg/ml范围内，脱氢VC浓度与峰面积呈良好的线性 关系，其线性回归方程为A = 4.3953C-2.9546，r = 0.9998，其中C单位为μg/ml，A为峰面积， 该技术方案能检测出较小范围内脱氢维生素 C的含量。
【附图说明】：
[0035]图1是实施例3中脱氢VC的标准曲线图
【具体实施方式】：
[0036]实施例1检测限和定量限的检测
[0037] 步骤（1)、精密称取脱氢VC对照品（含量为95.0% ) 19.91mg，置25ml量瓶中，加流动 相B溶解并稀释至刻度，摇匀；
[0038] 步骤(2)、精密量取步骤(1)中的溶液lml，置100ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度， 摇匀；
[0039] 步骤(3 )、精密量取步骤(2)中的溶液5ml，置100ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度， 摇匀，作为待测溶液；
[0040] 步骤(4)、精密量取20μ1，注入液相色谱仪，信噪比S/N=10:1，将该溶液作为定量 限溶液，定量限浓度为0.38μg/ml;
[0041] 步骤(5)、精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀， 精密量取20μ1，注入液相色谱仪，信噪比S/N = 3:1，将该溶液作为检测限溶液，检测限浓度 为0·llμg/ml。
[0042] 实施例2标准曲线的测定
[0043] 步骤（1)、精密称取脱氢VC对照品（含量为95.0% )40.90mg，置50ml量瓶中，加流动 相B溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；
[0044] 步骤（2)、精密量取步骤（1)中的溶液2.5ml、4ml、5ml、6ml、7.5ml、10ml，分别置 100ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀，分别作为线性溶液1、线性溶液2、线性溶液3、线 性溶液4、线性溶液5、线性溶液6;
[0045] 步骤(3)精密量取步骤(2)中的线性溶液1-6各20μ1，注入液相色谱仪，包括定量限 在内，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，线性方程为A = 4.3953C-2.9546，C 单位为ug/ml，Α为峰面积;相关系数为r = 0.9998。
[0046] 实施例3脱氢VC回收率测定
[0047] 步骤（1)、称取VC原料药约0.4g，置10ml量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，摇 匀，作为待测溶液;精密称取脱氢VC对照品（含量为95.0 % ) 11.63mg，置25ml量瓶中，加流动 相B溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液，精密量取lml，置10ml量瓶中，加流动相 B稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
[0048] 步骤(2)、精密称取VC原料药约0.4g三份，各置10ml量瓶中，分别加对照品贮备液 0.8ml、1.0ml、1.2ml，用流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为80 %、100 %、120 %组供 试品溶液，各个浓度水平平行配制3份。
[0049]步骤(3)、精密量取上述各溶液20μ1，注入液相色谱仪，以测得量与原有量之差与 加入量的比值，计算回收率，并计算相对标准偏差，结果如下表：
[0050]
[0051]
[0052] 实施例4 VC原料药(已变性含脱氢VC)的测定 [0053]步骤1、供试品溶液的配制
[0054] 取脱氢VC对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为对照品贮备液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀，作为 对照品溶液;取VC原料药(已变性含脱氢VC)约0.4g，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相B溶 解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0055]步骤2、液相色谱条件为：
[0056] 色谱柱:HILIC亲合色谱柱；
[0057] 流速：1 .Oml/min;
[0058] 柱温：35 Γ;
[0059] 检测器:紫外检测器
[0060] 检测波长：226nm;
[0061] 进样量:20μ1。
[0062]流动相:Α相：乙臆一异丙醇-水(87:10:3) ;Β相：乙臆-水(70:30);
[0063]流动相Α、Β按如下梯度程序进行：
[0064]
[0065]精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，按上述条件进行分析，结果为：维生 素 C原料药中脱氢维生素 C和维生素 C完全分离，分离度为6.21，脱氢VC出峰时间在 7.947min，VC出峰时间为10.850min，脱氢VC 含量为2.15μg/ml。
[0066]实施例5 VC原料药(已变性含脱氢VC)的测定 [0067]步骤1、供试品溶液的配制
[0068] 取脱氢VC对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为对照品贮备液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀，作为 对照品溶液;取VC原料药(已变性含脱氢VC)约0.4g，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相B溶 解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0069] 步骤2、色谱条件为：
[0070] 色谱柱:HILIC亲合色谱柱；
[0071] 流速：1 .Oml/min;
[0072] 柱温：35Γ;
[0073] 检测器:紫外检测器 [0074]检测波长：226nm;
[0075] 进样量:20μ1。
[0076] 流动相:Α相：乙腈一异丙醇-水(85:12:3) ;Β相：乙腈-水(75:25);
[0077]流动相Α、Β按如下梯度程序进行：
[0078]
[0079] 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，按上述条件进行分析，结果可知，在 该条件下维生素 C原料药中脱氢维生素 C和维生素 C完全分离，分离度为5.32，脱氢VC出峰时 间在8.005min，VC出峰时间为10.605min，脱氢VC含量为2.09μg/ml。
[0080]实施例6注射用复方维生素(3)中脱氢VC的测定(已发生变性，含脱氢VC)
[0081]步骤1、供试品溶液的配制
[0082] 取脱氢VC对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为对照品贮备液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀，作为 对照品溶液;取注射用复方维生素(3)(已发生变性)约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，加 流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0083]步骤2、其色谱条件为：
[0084] 色谱柱:HILIC亲合色谱柱；
[0085] 流速：0.8-1.2ml/min;
[0086] 柱温：30-40 Γ;
[0087]检测器:紫外检测器
[0088] 检测波长：220-230nm;
[0089] 进样量：20μ1。
[0090]流动相:A相：乙腈一异丙醇-水(89:8:3) ;B相：乙腈-水(65:35);
[0091]流动相A、B按如下梯度程序进行：
[0092]
[0093]精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，按上述条件进行分析，结果为：在该 条件下注射用复方维生素(3)中脱氢VC)的测定和维生素 C完全分离，分离度为5.46,脱氢VC 出峰时间在7.869min，VC出峰时间为10.392min，脱氢VC含量为2.54μg/ml。
[0094]实施例7复方维生素（13)中脱氢VC的测定(已发生变性，含脱氢VC)
[0095]步骤1、供试品溶液的配制
[0096] 取脱氢VC对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度， 摇匀，作为对照品贮备液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度，摇匀，作为 对照品溶液;取复方维生素（13)(已发生变性，含脱氢VC)注射液10ml，置10ml量瓶中，摇匀， 作为供试品溶液。
[0097]步骤2、液相色谱条件为：
[0098] 色谱柱:HILIC亲合色谱柱；
[0099] 流速：l.〇ml/min;
[0100] 柱温:35°C;
[0101] 检测器:紫外检测器
[0102] 检测波长：226nm;
[0103] 进样量:20μ1。
[0104] 流动相:Α相：乙腈一异丙醇-水(87:10:3) ;Β相：乙腈-水(75:25);
[0105]流动相Α、Β按如下梯度程序进行：
[0106]
[0107]
[0108] 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，按上述条件进行分析，结果为:在该 条件下复方维生素（13)中脱氢VC的测定和维生素 C完全分离，分离度为5.85,脱氢VC出峰时 间在7.845min，VC出峰时间为10.489min，脱氢VC含量为3.56μg/ml。
【主权项】
1. 一种检测维生素 c中脱氨维生素 c的方法，其特征在于，采用高效液相色谱仪测定，其 色谱条件为： 色谱柱:HILIC亲合色谱柱； iflL3E：〇.8-l .2ml/min； 柱溫:30-40 °C; 紫外检测器检测波长:220-230nm; 进样量：1〇-3〇μ1; 流动相:A相：乙腊--异丙醇-水； B相：乙腊-水； 流动相A、B按梯度程序进行。2. 根据权利要求1所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，所述 HILIC亲合色谱柱规格为:250mm X 4.6mm，5皿。3. 根据权利要求1所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，所述流 动相:A相中乙腊--异丙醇-水的体积比为:85~89:8~12:3; B相中乙腊-水的体积比为65~ 75:25~35。4. 根据权利要求3所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，所述流 动相:A相乙腊--异丙醇-水的体积比优选为：86~87:9~11:3 ;B相乙腊-水的体积比优选 为：68~73:28~32。5. 根据权利要求1所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，所述的 进样溫度为35 °C。6. 根据权利要求1所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，所述的 进样量为20μ1。7. 根据权利要求1所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，所述的 梯度程序为：8. 根据权利要求1所述的一种检测维生素 C中脱氨维生素 C的方法，其特征在于，该方法 可用于检测注射用复方维生素(3)及复方维生素(13)注射液中脱氨维生素 C的含量。
【文档编号】G01N30/74GK105974040SQ201610498365
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】张颖, 李永福, 姜明明, 翟雪梅, 朱召贞
【申请人】济南康和医药科技有限公司