专利名称：产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌基因工程菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种高产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌 的基因工程菌及其制备方法和所用的重组载体和转化体。
背景技术：
柔红霉素以及以其为原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(印irubicin)是 目前临床上十分重要的抗肿瘤蒽环类抗生素。表阿霉素的心脏毒性和骨髓毒性比阿霉素更 低，而抗肿瘤的效果相当或更高。表柔红霉素(印i-daimorubicin)是工业生产表阿霉素的 重要前体，其与柔红霉素的差别仅在于分子中脱氧糖C4位羟基构型不同。由化学合成法 从柔红霉素到表柔红霉素需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，并会造成环境污染。如 果采用微生物发酵方法直接生产将会大大节约成本，提高效率。若要柔红霉素的产生菌改 造成可以直接在体内合成表柔红霉素的菌株，需要改变TDP-L-柔红糖胺的生物合成过程 中的一个步骤。其中dnmV为TDP-6-脱氧糖C4酮基还原酶，它决定了菌株分子中脱氧糖 C4位羟基构型反应，使其生成柔红霉素。阿韦菌素酮基还原酶即ave BIV的与dnmV的立 体选择性正好相反。威斯康辛大学的Hutchinson教授将aveBIV基因，导入柔红霉素产生 菌(波赛链霉菌)，并中断柔红糖胺的产生，构建的工程菌产生表柔红霉素(Krishnamurthy Madduri，Jonathan Kennedy，Giovanni Rivola,et al. Production of the antitumor drug epirubicin(4 ' _epidoxorubicin)and its precursorby a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius [J]. NatureBiotechnology, 1998,16 :69_74)。而本申 请人之前在产柔红霉素天蓝色链霉菌SIPI-1482中，中断了柔红糖胺生物合成基因dnmV， 插入了 aveBIV基因和阿伯拉霉素(又名安普霉素)的抗性基因，构建了表柔红霉素产生菌 (中国专利申请200610146614. 6)。这种方法构建的工程菌产表柔红霉素产量较低，经过我 们验证其发酵产量不超过20mg/L，且不稳定，连续传代2次以上发酵单位就有明显的降低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉 菌的基因工程菌表柔红霉素产量不高，遗传稳定性低的不足，提供一种改良的生产表柔红 霉素的天蓝淡红链霉菌基因工程菌，该菌表柔红霉素产量大大高于现有的表柔红霉素生产 菌，并且传代非常稳定。本发明还提供该生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌 的制备方法和所用的重组载体和转化体。本发明人经过仔细研究和反复试验发现，生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基 因工程菌中的外来插入基因包括抗生素抗性基因和aveBIV基因。抗生素抗性基因有2kb的 长度，是筛选标记，aveBIV基因是使天蓝淡红链霉菌产生表柔红霉素的基因，外来插入基因 片段过大，影响了工程菌的遗传稳定性和表柔红霉素的产量。因此，本发明人将外来基因改 变为仅由aveBIV基因及其启动子组成，没有加入抗生素抗性基因，大大减小外来基因的长 度。在此基础上，本发明还发现，通过接合转移转入含有启动子和aveBIV基因的整合质粒，使红霉素启动子和aveBIV基因随机整合到整个基因组上，倍增了红霉素启动子和aveBIV 基因，从而可以筛选到表柔红霉素产量进一步增高的突变菌株。本发明人还发现，在基因工 程菌的制备中增加同源重组双交换的交换臂长度可以大大增加双交换的频率，筛选双交换 子的工作量大大减小，从而快速的完成了本发明。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种生产表柔红霉素的天蓝 淡红链霉菌的基因工程菌，其是一种在天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者 置换为包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻断而表达aveBIV(阿维菌素酮 基还原酶)的基因工程菌，其中，该基因工程菌的基因组中还整合着第二外源基因，所述的 第一外源基因和第二外源基因都是启动子和aveBIV基因的连锁片段。根据本发明，所述的启动子较佳的是红霉素启动子，更佳的所述的启动子的核苷 酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列。所述的aveBIV基 因又称阿维菌素酮基还原酶基因。所述的aveBIV基因的核苷酸序列较佳的是如序列表中 SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。所述的dnmV基因又称胸腺嘧啶核苷二磷酸_6_脱 氧糖C4酮基还原酶基因。根据本发明，所述的第一外源基因插入于天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因 中，或者与dnmV基因中的DNA片段置换。所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因序列 被外来基因置换的部分最大长度可以是整个dnmV基因，较佳的是dnmV基因的第273位 675位之间的核苷酸片段被置换掉。因此，dnmV基因被阻断而不能表达。而插入的第一外 源基因，即启动子和aveBIV基因的连锁片段可以表达，从而使该被改造了的天蓝淡红链霉 菌可以产生表柔红霉素。根据本发明，所述的第二外源基因整合于本发明的天蓝淡红链霉菌基因工程菌的 基因组中。在基因组中的整合位置是在基因组的任何位置，只要不影响菌株本身的生物合 成，能够高产表柔红霉素的情况，都在本发明的保护范围之内。根据本发明，所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株较佳的选用国内工业用菌株——天 蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本发明先构建了一种重组穿梭质粒，其含有由在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmV 基因连锁的上游基因或其片段、dnmV基因5’端片段、启动子、aveBIV基因、dnmV基因3’端 片段、以及在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmV基因连锁的上游基因或其片段依次连锁组 成的DNA片段。在野生型天蓝淡红链霉菌中，基因dnmZ、dnmU、dnmV、dnmj和dnml依次连 锁表达，dnmZ和dnmU在dnmV的上游，dnmj和dnml在dnmV的下游，该连锁基因的核苷酸 序列已公开(GenBank登录号AF006633)。本发明的重组穿梭载体中含有的重组片段较佳 的则是在上述连锁序列的dnmV基因序列中插入或者由部分dnmV基因序列置换成启动子 和aveBIV基因的序列。dnmV基因中被置换序列的长度最大可以是整个dnmV基因，较佳的 是dnmV基因中间的核苷酸序列。也就是说，本发明的重组穿梭载体含有的重组DNA序列较 佳的是由dnmZ基因或其片段、dnmU基因、在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmU基因连锁的 dnmV基因片段、启动子、aveBIV基因、在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmj基因连锁的dnmV 基因片段、dnmj基因和dnml基因或其片段依次连锁组成的DNA片段。本发明中所述的启 动子较佳的是红霉素启动子。较佳的，所述的重组穿梭载体中含有的重组片段，即所述的依 次连锁组成的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。其中第1 617位核苷酸序列是所述的dnmZ基因片段；第618 1251位核苷酸序列是所述的dnmU基因；第 1252 1524位核苷酸序列是所述的在天蓝淡红链霉菌基因组中与dnmU基因连锁的dnmV 基因片段；第1525 2198位核苷酸序列是所述的红霉素启动子；第2199 3492位核苷 酸序列是所述的aveBIV基因；第3493 3741位核苷酸是所述的在天蓝淡红链霉菌基因 组中与dnmj基因连锁的dnmV基因片段；第3742 4855位核苷酸是所述的dnmj基因；第 4856 5028位核苷酸是所述的dnml基因。本发明构建的重组穿梭质粒可用于与天蓝淡红链霉菌基因组发生同源双交换，从 而得到生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述 的dnmZ、dnmU和与dnmU连锁的dnmV片段的部分是发生同源重组双交换的左臂；与dnmj连 锁的dnmV片段、dnmj和dnml的部分是发生同源重组双交换的右臂。启动子和aveBIV基 因的部分是发生重组双交换时导入的外来基因。所述的左臂的长度可以是500 2000bp， 较佳的是1525bp，即序列表中SEQ ID NO. 1第1 1524位所示的序列。所述的右臂的长度 可以是500 2000bp，较佳的是1536bp，即序列表中SEQ IDN0. 1第3293 5028位所示的 序列。根据本发明，所述的重组穿梭质粒的骨架较佳的是质粒pKC1139。将所述的重组穿梭质粒转化宿主细胞，得到转化子。所述的宿主细胞较佳的是大 肠杆菌ET12567。将该转化子和天蓝淡红链霉菌接合，挑选同源双交换接合子。所述的天蓝 淡红链霉菌较佳的是天蓝淡红链霉菌SIPI-1482。该同源双交换接合子即dnmV基因中插入 了 aveBIV基因的天蓝淡红链霉菌突变株。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种重组载体，其含有启 动子和aveBIV基因的连锁片段。根据本发明，所述的重组载体的载体骨架较佳的是质粒 PSET152。所述的启动子较佳的是红霉素启动子(ErmP)。所述的启动子和aveBIV基因的连 锁片段的核苷酸序列较佳的如序列表中SEQ ID NO. 1第1525 3492位所示。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是一种转化子，其含有所述的 重组载体。根据本发明，所述的转化子的宿主细胞较佳的是大肠杆菌ET12567。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是一种制备生产表柔红霉素的 天蓝淡红链霉菌的基因工程菌的方法，其中，包括将如上所述的转化子与产表柔红霉素的 天蓝淡红链霉菌接合，挑选接合子。用阿伯拉霉素筛选，能长出的就是质粒已经整合在基因 组上的接合子。根据本发明，所述的产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌较佳的是基因组中的 dnmV基因中插入了 aveBIV基因的天蓝淡红链霉菌突变株。所得的接合子即本发明的生产 表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，其基因组中整合着2个外源基因，这两个外 源基因都是启动子和aveBIV基因的连锁片段。所述的产柔红霉素的天蓝淡红链霉菌较佳 的是天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482。本发明所述的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌可用于生产表柔红霉素。因此，本发 明还提供一种制备表柔红霉素的的方法，包括培养本发明上述天蓝淡红链霉菌的基因工程 菌，从培养物中获得表柔红霉素。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明将产柔红霉素的天蓝色淡红链 霉菌进行改造，一方面敲除了其中的部分dnmV基因，置换入aveBIV基因，通过基因置换法得到了生产的表柔红霉素的工程菌；另一方面，通过随机互补法，将另一个aveBIV基因整 合入基因组中，从而在最低限度影响菌株本身生物合成的情况下2次转入aveBIV基因，从 而使得表柔红霉素的产量又有了很大的一个提高。本发明所构建的工程菌，不含有任何抗 性标记，很方便用于进一步的基因工程改造。本发明所构建的工程菌，表柔红霉素产量远远 大于现有的方法，最好可达70mg/L。本发明所构建的工程菌，通过连续传代，表柔红霉素产 量非常稳定，重复性好。在本发明的制备方法中，增加了双交换双臂的长度。中国专利申请 200610146614. 6公开的方法中，交换双臂的长度是700bp，本发明的优选方案中交换双臂 的长度是1500bp，增大了双交换发生的几率，加快双交换接合子的筛选。本发明采用PCR来 筛选突变株，解决了插入抗性基因作为筛选标记(例如阿伯拉霉素抗性基因)，插入外来基 因片段过大所带来的影响上下游基因的转录的问题，从而保持剩下的dnmV基因的两端的 碱基和编码氨基酸不变，最大限度的减少中断dnmV和插入aveBIV基因对上下游的基因的 影响，大大增加了菌株的稳定性，提高了表柔红霉素产量。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是含aveBIV基因的重组质粒的构建示意图。图2是定点插入质粒的构建示意图。图3是表柔红霉素生产菌的构建策略示意图。图4是PCR验证的电泳图。M，marker ;1，双交换基因型；2，回复基因型。图5是产表柔红霉素的工程菌的发酵液的HPLC分析图谱。图 6 是 PCR 验证的电泳图。M，marker ； 1，ErmP+aveBIV。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。所使用的工具酶和DNA分子量标记均购自宝生物公司(Takara)，具体的反应条件 和使用的方法均参考商品说明书所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法 参考商品说明书。大肠杆菌E. coli DH5a、ET12567，购自上海鼎国生物技术有限责任公司。天蓝淡红链霉菌SIPI-1482可从上海医药工业研究院取得。实施例1双交换左右臂与aveBIV序列的克隆在天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中，dnmZ和dnmU依次在dnmV的上游，dnmj和dnml 依次在dnmV的下游，本发明取dnmZ、dmnU加一部分dmnV作为双交换的左臂，dnml、dnmj加 一部分dmnV作为双交换的右臂来构建双交换质粒。首先根据已经发表的天蓝淡红链霉菌 SIPI-1482相应序列(GenBank登录号AF006633)设计引物左臂上游引物为5，-AAAAAGCTTCTGGGACGGAATGGGC-3，，左臂下游引物为5，-AAATTCGAATCGCACCAGTCGCAGATG-3，；
右臂上游引物为5，-AAATCTAGAGGGCTGGTCGTCAACATC-3，，右臂下游引物为5，-AAAGGATCCCATCAAACTCCGCAAGACAT-3，。上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的 总基因组为模板。使用宝生物公司的primer star高保真DNA聚合酶来进行片段的克隆。 PCR条件为98°C，10s、66°C，15s、72°C，2min。PCR产物上样电泳后，回收目的条带。回收 的片段与质粒进行连接，左臂PCR产物联入质粒PSP72 (购自上海生工生物工程技术服务 有限公司)，接入位点Hindlll和Xbal，命名为pSL-02-3-1并测序；右臂PCR产物联入质 粒pSP72，接入位点Xbal和EcoRV，命名为pSL_R15，并测序。左臂序列与GenBank登录号 AF006633中的相应序列比对为97. 4%的同源性，右臂序列与编号AF006633中的相应序列 比对为99. 3%的同源性。在PubMed上查到aveBIV的基因序列，设计相应的引物上游引物5’-AAAAGATCT GCACGGGTCAACGGGTAA-3，，下游引物5，-AAAAGATCTTGATGTCGAGCGGCTACG-3，。以阿维链霉 菌S. avermitilis (购自ATCC公司)的总DNA为模板，用primer star高保真DNA聚合酶 扩增得到aveBIV的基因。aveBIV基因连入质粒pSP72，连接位点Bglll和Bglll，得到质粒 pSL-02-20-l。以红霉素生产菌株S. erythraea HL 3168E3 (购自ATCC公司)的基因组为模板，上 游引物 5，-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3，，下游引物 5，-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3，， 进行PCR，所得PCR产物纯化后连接在质粒pGEM-3zf (购自上海生工)上，得到质粒 pSL-HM-312,即含有红霉素启动子的重组载体。用限制性内切酶EcoRI和BamHI从质粒 pSL-HM-312切得红霉素启动子，把红霉素启动子连入质粒pSET152(购自上海生工生物 工程技术服务有限公司)得到pSL-02-18-1，接入位点为EcoRI和BamHI。用Bglll从 pSL-02-20-1切的aveBIV基因正向连入pSL-02-18-1，此质粒即为插入红霉素启动子和 aveBIV结构基因的pSET152随机整合质粒，命名为pSL-02-22_l。设计并合成PCR引物，上 游引物为 5，-AAATCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3，，下游引物为 5，-AAATCTAGATGATGTCGAG CGGCTACG-3，。以质粒pSL-02-22-l为模板，扩增出红霉素启动子和aveBIV基因连锁的DNA 片段(ErmEP+aveBIV基因)，联入质粒pSP72，接入位点Xbal和Xbal，得到重组质粒，命名 为pSL-02-26-1，测序，所得aveBIV基因的核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO. 1第2199 3492位所示，与NCBI数据库中的的aveBIV基因序列(序列登录号AB032523)比对的同源 性为100%，质粒构建过程见图1。实施例2双交换定点插入质粒的构建、接合转移实施例1中的右臂联入质粒pKC1139(购自上海生工生物工程技术服务有限公 司公司)，接入位点Xbal和EcoRV，得到质粒，命名为pSL-02-7-1。左臂正向联入质粒 pSL-02-7-1，接入位点Hindi 11和Xbal，得到质粒，命名为pSL-02-12-l。采用限制性内切酶 Xbal从实施例1中的pSL-02-26-1质粒中切出ErmEP+aveBIV基因正向联入pSL-02_12_l 中，此质粒即为双交换敲除dmnV，同时定点插入aveBIV的表柔红霉素表达整合质粒。用此 质粒转化大肠DH5 a，调取转化子在LB中培养，提取质粒进行酶切和PCR验证，最终构建成 双交换定点插入质粒，命名为pSL-02-30-1。构建策略见图2。从天蓝淡红链霉菌SIPI-1482斜面挑取适量菌体于50ml TSB培养基中培养56小 时左右达到对数生长期，(v/v)接种量转接于50ml TSB培养基中培养48小时左右使菌体达到对数生长后期，离心倒去上清得到菌丝体，菌丝体用20ml的LB液体培养基洗涤2次 (4000rpm, IOmin, 4°C )，最后重悬于20ml LB培养基中，待用。用pSL-02-30-l转化感受态 大肠杆菌ET12567，挑转化子至装有4ml LB培养基[含阿伯拉霉素(Am) 100 μ g/ml、卡那霉 素(Kn)25yg/ml、氯霉素(Cm) 100 μ g/ml]的小试管中，37°C振荡培养12小时。大肠杆菌 ET12567接种于装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，37°C振荡培养4小时左右，使菌液 OD值在0. 4 0. 6之间，将菌液移入50ml的无菌塑料离心管，离心(4000rpm, IOmin, 4°C )， 倒去上清，菌体用20mlLB培养基洗涤2次(4000rpm，10min,4°C )，最后重悬于1 2ml LB 培养基中。将该大肠菌液与之前待用的天蓝淡红链霉菌SIPI-1482菌丝体以1 1(重悬 液体积比)于EP管中混勻。将混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混勻菌液，30°C恒温箱培 养。培养20小时后，取出平板，涂抗生素，用量为每10个平板涂IOml双蒸水、100 μ 1 Am和 400μ1萘啶酸(NC)的混合液，再于30°C恒温箱培养。培养一周后出现接合子。表柔红霉 素产生菌的构建过程见图3。实施例3双交换工程菌的筛选挑取实施例2所得的接合子于装有4ml TSB培养基的小试管中(含Am50 μ g/ml、 试管中加入2 3粒直径2 5毫米的玻璃珠)，30°C振荡培养。菌液摇浓后，取1 μ 1菌液 稀释于Iml无菌水中，混勻后取100 μ 1涂含Am 50 μ g/ml的高氏一号平板，37°C培养。因 为PKC1139质粒是温敏型质粒，只有整合到染色体上才能存活，所有出来的整合子已经发 生过同源重组交换。4至5天后，挑取整合子于无抗生素的TSB培养基中培养，连续传代， 促使其发生双交换。取第3代菌液1 μ 1，稀释于IOml的无菌水中，混勻后取100 μ 1涂高 氏一号平板(无抗性)，30°C培养。4至5天后，出现单菌落，挑取同一个单菌落分别在有抗 性与无抗性的平板上培养，筛选无抗性平板生长，而抗性平板不生长的菌落，得到30个菌 落。在无抗性平板生长而在抗性平板不生长的克隆就是发生双交换或者回复的克隆。挑取 菌落在液体TSB培养基中培养，然后抽提其总DNA。在左右臂上设计相应的引物，上游引物 5，-ACGGGTGGGACGTGCAC-3，，下游引物5，-CACATGCTGTGGACGGAG-3，，进行 PCR 验证。PCR 产 物的电泳图见图4。扩增出SOObp的片段的是回复型的野生菌株基因组，扩增出2400bp的 片段的是双交换突变株基因组。我们从30个菌落中筛选到6个双交换突变株，双交换发生 几率很高。实施例4产表柔红霉素的工程菌的发酵验证挑取实施例3中能扩增出2400bp片段的双交换突变株于高氏一号斜面30°C培养， 培养15天后，接种于种子培养液(淀粉2. O,玉米粉2. O,葡萄糖1. 0，麸皮1. 0，麸质粉1. 0， MgSO4O. 1，K2HP040. l(g/100ml))。种子培养液培养2天后转接于发酵培养基(玉米粉7.0，葡 萄糖 1. 0，麸皮 1. 0，麸质粉0. 75，K2HPO4O. 01，(NH4)2SO4O. 1)，接种量 10% (v/v)。30°C，220r/ m培养5天后放瓶，发酵液用草酸调pH值至5左右，再加2倍体积的丙酮混勻浸泡5小时以 上，离心后取上清做HPLC分析。HPLC条件，流动相0. (ν/ν)甲酸的乙腈0.1% (ν/ ν)甲酸的水溶液=72 28，流速lml/min，柱温35°C，检测波长254nm，进样量5μ 1，分 析柱Agilent ClS0 HPLC分析结果见图5，可见通过双交换定点插入的工程菌，发酵产物 中已经不存在柔红霉素组分，而表柔红霉素的浓度在45mg/L左右。实施例5aveBIV整合质粒转入aveBIV置换dnmV的表柔突变株(1)用随机整合质粒pSL-02-22-1转化大肠杆菌ET12567感受态细胞，挑转化子至4ml LB (AmlOO u g/ml, Kn25 u g/ml, CmlOO u g/ml)的小试管中 37°C振荡培养 12 小时，然后 按2% (v/v)的接种量转接于50ml LB的250ml三角瓶，37°C振荡培养4小时左右，使菌液 0D值在0. 4 0. 6之间，将菌液移入50ml的无菌塑料离心管，离心(4000rpm, lOmin, 4°C )， 倒去上清，菌体用20ml LB洗涤2次(4000rpm，10min,4°C )，最后重悬于1 2ml LB中，备用。(2)挑取实施例3中所得的能扩增出2400bp片段的双交换突变株于高氏一号斜 面，30°C培养15天后，从斜面挑取适量菌体于50ml TSB中培养56小时左右达到对数生长 期，按(v/v)的接种量转接于50ml TSB培养48小时左右使菌液达到对数生长后期，离 心倒去上清得到菌丝体，菌丝体用20ml的LB液体洗涤2次(4000rpm，lOmin, 4°C )，最后重 悬于20ml LB，备用。(3)将步骤(1)中所得备用的大肠菌液与步骤(2)中所得备用的菌丝体按重悬液 体积比1 1于EP管中混勻。将混合菌液涂MS平板，用涂棒充分混勻菌液，30°C恒温箱培 养。培养20小时后，取出平板，涂抗生素仏11150118/111(奈啶酸)50118/1111)，再于301 恒温箱培养。培养一周后长出的菌落即为接合子。NC是抗大肠杆菌的，所以所得菌落不可 能是质粒pSL-02-22-1随机整合大肠杆菌的转化子，而双交换突变株是不能在Am抗性下存 活的，所以经过Am和NC的筛选就得到了目的接合子。实施例6突变株总DNA的抽提以及基因型的验证挑取接合子于液体TSB培养中(Am 50 u g/ml)进行抗性验证，30°C，220r/m培养2 天后筛选出可以生长的菌株。取上述可以在抗性TSB中培养的菌液1.5ml，离心倒去上清， 用500 ill 31￡重悬菌丝体后，800017/!^11离心2111111，倒掉上清后重复洗涤一次。500111 STE 悬浮菌丝体，加入溶菌酶，终浓度为2mg/L (溶菌酶为固体，可以先加入STE中，配成2mg/L)， 37°C，水浴30min。然后加入250 yl，2% (w/v)的SDS振勻。加入250 yl的酚氯仿(体 积比1 1)振勻，15000r/min，10min，取上清(分界处有白色变性蛋白质，由于整个上清 比较黏稠，需要连着变性蛋白质一起吸入)。重复上一步骤7 8次至上清无明显黏稠现 象。接着用与上清等体积的氯仿抽提酚，移取上清，加入1/10体积的3M NaAC，加等体积异 丙醇，来回颠倒混勻，室温放置30min，12000r/min离心5min。最后用70% (v/v)乙醇洗涤 一次，于室温挥干，得到的白色固体即总DNA，将其溶于50 yl的双蒸水。以此总 DNA 作为模板，利用通用引物 M13-47 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3‘ 和 RV-M:5' -GAGCGGATMCMTTTCACACAGG-3 ‘进行 PCR。PCR 程序95 °C，3min ;94°C，lmin ； 55°C，lmin ；72°C，lmin (步骤二到步骤四30个循环)；最后72°C，2min。PCR产物电泳图见图 6。可见PCR产物是大约2KB左右的片段，就是ErmP+aveBIV的大小，表明ErmP+aveBIV已经 转入整合质粒。实施例7产表柔红霉素的工程菌的发酵验证挑取接合子于含有50mg/L阿伯拉霉素的高氏一号斜面，30°C培养15天后，挑取适 量菌体于种子液中培养，30°C，220r/m培养2天后转接于发酵培养基，30°C，220r/m培养5 天后放瓶，发酵液用草酸调PH值至pH5，再加2倍体积的丙酮混勻浸泡5小时，离心后取上 清做HPLC分析。HPLC条件，流动相0. (v/v)甲酸的乙腈0.1% (v/v)甲酸的水溶 液=72 28，流速:lml/min，柱温:35°C，检测波长:254nm，进样量:5iil，分析柱:Agilent C18。HPLC分析结果显示所有通过双交换定点插入以及倍增aveBIV的工程菌单菌落发酵产物中都已经没有柔红霉素，而表柔红霉素的浓度都有所提高，最高达70mg/L左右。序列表<110>上海医药工业研究院<120>产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌基因工程菌及其制备方法<130>P4-091166C<160>1<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>5028<212>DNA<213>Artificial<220><223> 重组 DNA<220><221>misc_feature<222>(62). . (62)<223>n is a, c, g, or t<220><221>promoter<222> (1525) (2198)<223>红霉素启动子<220><221>gene<222> (2199) (3492)<223>aveBIV 基因<400>1ctgggacggagntggaccggcgccgggcaggaggatcgccggtggccgagcaccgccgacgatgacgccccgactgcctggtaccgcgatctacctgagcggagtcggagagccggaggttcacggccgc
10
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11
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1权利要求
一种生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，其是一种在天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置换为包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻断而表达aveBIV的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的基因组中还整合着第二外源基因，所述的第一外源基因和第二外源基因都是启动子和aveBIV基因的连锁片段。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列是序列 表中SEQ ID NO. 1的第1525 2198位所示的核苷酸序列，所述的aveBIV基因的核苷酸序 列是如序列表中SEQ ID NO. 1的第2199 3492位所示。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株的 dnmV基因的第273位 675位之间的核苷酸片段被所述的第一外源基因置换掉。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的第二外源基因在基因组中的 整合位置是在基因组的任何位置。
5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的天蓝淡红链霉菌野生菌株是 天蓝淡红链霉菌 Sti^ptomyces coeruleorubidus SIPI-1482。
6.一种重组载体，其含有启动子和aveBIV基因的连锁片段。
7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体的载体骨架是质粒 PSET152，所述的启动子和aveBIV基因的连锁片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 第1525 3492位所示。
8.一种转化子，其特征在于，其含有权利要求6 7任一项所述的重组载体。
9.如权利要求8所述的转化子，其特征在于，所述的转化子的宿主细胞是大肠杆菌 ET12567。
10.一种制备生产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌的方法，其特征在于，包 括将如权利要求8所述的转化子与产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌接合，挑选接合子。
11.一种制备表柔红霉素的的方法，其特征在于，包括培养如权利要求1 5任一项所 述的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，从培养物中获得表柔红霉素。
全文摘要
本发明公开了一种高产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌，其是一种在天蓝淡红链霉菌野生菌株的dnmV基因中插入或者置换为包含aveBIV基因的第一外源基因，使dnmV基因被阻断而表达aveBIV(阿维菌素酮基还原酶)的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的基因组中还整合着第二外源基因，所述的第一外源基因和第二外源基因都是启动子和aveBIV基因的连锁片段。本发明所构建的基因工程菌，不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造；表柔红霉素产量远远大于已有方法，最好可达70mg/L；通过连续传代，表柔红霉素产量非常稳定，重复性好。
文档编号C12N1/21GK101892185SQ200910051619
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者景兰, 李继安, 邵雷, 陈代杰, 黄佳 申请人:上海医药工业研究院