一种表达穿膜肽融合蛋白的基因工程菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，一种表达穿膜肽融合蛋白的基因工程菌及 应用。 技术背景
[0002] 猪瘟（classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种急性、发热性、致死性传染病。该病具有高度接触传染性，曾在国 际上广泛流行，发病率高，死亡率高达90%以上，危害极大，给当时的养猪业造成巨大的经 济损失，被世界卫生组织（OIE)列入重要畜禽传染病名录。目前，我国是世界上猪瘟疫苗生 产和使用最多的国家，每年的总消耗量约为40亿头份以上，市场总价约为20亿元人民币。
[0003] 长时间的疫苗免疫以及其他疫病的干扰，猪对猪瘟疫苗正在逐渐甚至逐代产生了 耐受能力，其应答反应减弱或变慢，致使近年来猪瘟疫苗免疫失败的情况经常出现，温和型 猪瘟、亚临床症状猪瘟不断流行，每年因此给我国养猪业造成近100亿元经济损失。这种形 势对猪瘟疫苗的质量提出了新的要求，亟需提高我国猪瘟疫苗的效价。
[0004] 猪瘟疫苗的效价与猪瘟病毒的培养过程有着极其密切的关系，猪瘟病毒依 靠与敏感细胞的表面受体结合进入细胞，在细胞内扩增再释放于培养液中[王镇，陆 宇，周鹏程，等.猪瘟病毒在PK细胞和MPK细胞中繁殖过程的研宄[J].微生物学报， 1999, 39(3) : 189-194.]。但在培养过程中，即使是处于同一培养容器中的同种细胞，并非所 有的细胞个体都对接种的病毒易感，这也就是说，同一培养容器中的细胞接种病毒后，并非 所有的细胞体内都会有病毒进入扩增，而且猪瘟病毒培养时，只有少部分细胞有病毒进入， 大多数细胞是在随着培养时间的延长而慢慢增加进入病毒的细胞数量[王镇，陆宇，丁明 孝.猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研宄[J].中国病毒学， 2000, 15 (23) : 170-179.]。这就造成了两个结果：1、培养起始阶段，参与扩增病毒的细胞较 少，病毒效价难以升高，2、细胞扩增病毒的速度不同步，在培养温度下，先从细胞中释放出 来的病毒活力下降，这使得培养液达到标准毒价的时间延长。因此，我们认为：如何使同一 培养容器中接种的病毒在尽可能短的时间内进入最多的细胞个体中扩增，将可能是获得高 效价猪瘟病毒的关键。
[0005] PEP-I是一种膜转导蛋白，也叫穿膜蛋白，该类蛋白可以自由出入细胞膜，人们使 用该类蛋白将某些不能透过细胞膜的药物带进细胞膜内取得了理想的效果，而CD46蛋白 则是猪瘟病毒特异性受体，能在培养液中特异性捕获猪瘟病毒。本发明专利将这两种蛋白 用基因表达的方式连接起来，依靠 CD46蛋白捕获培养液中的猪瘟病毒，再依靠 PEP-I蛋白 的穿膜作用将捕获的猪瘟病毒带入细胞内，使培养体系中在短时间内将猪瘟病毒强行导入 尽可能多的细胞内进行扩增，达到大幅度提高猪瘟病毒培养效价的目的。
[0006] SAPGTP是一种融合蛋白接头，也叫连接肽，将两个都有活性的功能蛋白连接起来， 构建形成融合蛋白后，各蛋白都能保持各自的活性。保证两者的多肽链既能正确折叠连接 在一起而仍有活性，又能使两者的活性中心彼此远离，不会形成空间位阻而影响活性的表 现，更不能使活性相互影响甚至抑制。通过计算机同源模建的方法比较，预测到SAPGTP接 头能很好的将PEP-I穿膜蛋白和CD46蛋白融合在一起，不会影响该融合蛋白的表达量，也 不会影响融合蛋白中不同结构域的正确折叠与相应的生物学活性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一种能提高猪瘟病毒培养效价的重组蛋白PEP-I-⑶46， 其序列为SEQ ID NO. 2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。本发明将PEP-I穿 膜蛋白与CD46蛋白融合表达，得到具有生物活性的PEP-1-CD46蛋白，利用CD46蛋白捕获 培养液中的猪瘟病毒，再依靠 PEP-I蛋白的穿膜作用将捕获的猪瘟病毒带入细胞内，使培 养体系中在短时间内将猪瘟病毒强行导入尽可能多的细胞内进行扩增，达到大幅度提高猪 瘟病毒培养效价的目的。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供了一种能提高猪瘟病毒培养效价的穿膜肽融合蛋 白的制备方法，该方法可应用于疫苗生产中，表达量大，操作简单，成本低。该融合蛋白能有 效提高猪瘟病毒在细胞内的增殖效果，提高病毒培养的毒价。
[0009] 本发明的再一个目的在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)pET-32a-PEP-l-CD46。该菌株可以表达蛋白转导结构域多 肽（PEP-I)和猪瘟病毒受体（⑶46)基因工程融合蛋白PEP-I-⑶46。其优点是表达量大， 可溶性蛋白，成本低，安全性好。该菌已于保藏于2014年12月5日送至中国典型培养物 保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO !M2014631，地址：中国武汉武汉大学，分类命名： Escherichia coli BL21(DE3)/pET-32a-CSFR。
[0010] PEP-1-CD46蛋白序列如下：
[0011] KETWWETffffTEffSQPKKKRKVSAPGTPMMAFCALRKALPCRPENPFSSRCFVEILffVSLALVFLLPMPS DACDEPPKFESMRPQFLNTTYRP⑶RVEYECRPGFQPMVPALPTFSVCQDDNTWSPLQEACRRKACSNLPDPLNGQV SYPNGDMLFGSKAQFTCNTGFYIIGAETVYCQVSGNVMAWSEPSPLCEKILCKPPGEIPNGKYTNSHKDVFEYNEVV TYSCLSSTGPDEFSLVGESSLFCIGKDEWSSDPPECKVVKCPYPVVPNGEIVSGFGSKFYYKAEVVFKCNAGFTLHG RDTIVCGANSTWEPEMPQCIKDSKPTDPPATPGPSHPGPPSPSDASPPKDAESLDGG IIAAIVVGVLAAIAVIAGG VYFFHHKYNKKRSK
[0012] PEP-1-CD46 核苷酸序列：
[0013] AAGGAAACATGGTGGGAAACGTGGTGGACTGAGTGGTCCCAGCCTAAAAAGAAGAGAAAGGTTTCTGCT CCAGGTACCCCTATGATGGCTTTCTGTGCTTTGCGTAAAGCTCTGCCATGTCGTCCAGAAAACCCATTTTCTTCTCG TTGTTTCGTCGAAATATTGTGGGTTTCTTTGGCTTTGGTTTTTCTATTGCCAATGCCTTCTGATGCCTGTGATGAAC CACCCAAGTTTGAATCTATGAGACCACAGTTCTTAAACACTACTTATAGGCCAGGTGATAGAGTCGAATACGAATGT AGACCTGGTTTTCAACCAATGGTTCCAGCCTTGCCAACTTTTTCTGTTTGCCAAGACGATAATACTTGGTCTCCATT GCAAGAAGCTTGTAGGAGAAAAGCTTGCTCTAATTTGCCAGATCCATTGAACGGTCAAGTTTCTTACCCAAATGGTG ACATGTTGTTTGGTTCTAAAGCCCAATTTACGTGTAACACAGGTTTTTACATTATTGGTGCTGAAACTGTTTACTGC CAAGTCTCTGGTAATGTCATGGCATGGTCCGAACCCTCTCCCTTGTGTGAAAAGATTTTGTGTAAGCCACCCGGTGA AATTCCTAACGGTAAGTACACTAACTCTCATAAGGATGTTTTTGAGTATAACGAGGTCGTTACTTACTCTTGTTTGT CTTCCACGGGACCAGATGAGTTTTCCTTGGTTGGTGAATCTTCTCTGTTTTGTATAGGTAAGGACGAATGGTCTTCT GACCCACCCGAGTGTAAGGTTGTTAAGTGCCCATACCCAGTTGTTCCCAACGGAGAAATTGTTAGTGGTTTCGGTTC AAAGTTCTATTACAAAGCAGAAGTCGTATTTAAGTGTAACGCCGGTTTTACTTTGCATGGTAGAGATACTATTGTCT GTGGTGCTAATTCTACTTGGGAGCCAGAAATGCCACAATGTATTAAGGATTCTAAACCAACTGATCCACCAGCTACT CCTGGTCCATCCCATCCAGGCCCACCCTCCCCATCAGATGCTTCTCCACCAAAGGATGCTGAATCATTGGACGGTGG TATTATAGCCGCTATTGTTGTTGGTGTTTTAGCTGCAATAGCTGTCATTGCTGGAGGTGTGTATTTCTTCCATCACA