专利名称：含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺以及纯化Kringle 5蛋白的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物、医药研制技术，采用基因重组技术在大肠杆菌中表达血 管生成抑制剂Kringle 5，通过正交试验对工程菌的发酵工艺进行了优化，并采 用亲合层析、阳离子交换层析两步法纯化目的蛋白。
背景技术：
Folkman等于1972年首次提出肿瘤的生长依赖于血管的生成，虽然小的 瘤体可以通过渗透作用从周围组织中获得营养，但它的进一步生长则依赖于形 成新的血管以获得充分的营养。血管生成不仅为肿瘤生长提供了必须的营养， 同时也为其扩散转移提供了重要的途径，许多实验己经证明了肿瘤的生长和迁 移依赖于血管的生成。通过抑制血管生成来抑制肿瘤的生长现在已经成为一种 新的治疗肿瘤的思路和方法。
1994年，0' Reilly等发现内源性血管生成抑制剂Angiostatin是由纤溶酶 原前四个饼环区组成。1997年，Cao等发现纤溶酶原N端的第五个饼环区 (plasminogen kringle 5)同样具有抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的能 力，而且抑制能力比Angiostatin更强。Kringle 1_3虽然具有抑制内皮细胞 增殖的活性，但对内皮细胞移行的抑制作用不大；Kringle 4虽然在阻止内皮 细胞移行方面起着重要作用，但几乎不表现出抑制内皮细胞增殖的活性；而 Kringle 5特异抑制内皮细胞增殖的活性最高，是迄今为止动物实验中抗肿瘤 血管生成最有效的药物之一。
近年来，国内外先后报道了有关肿瘤血管生长抑制剂Kringle 5基因的克 隆和表达，以及Kringle 1-4和Kringle卜3基因大肠杆菌的发酵工艺研究[13]， 但未见有关含Kringle 5基因的工程菌发酵条件优化和有关Kringle 5蛋白纯 化的系统地、全面的实验报道，阻碍了 Kringle 5蛋白的大规模生产和临床试 验。目前在基因工程菌发酵条件的优化方面，有关培养基优化的研究很少，且 主要通过单因素实验对发酵条件进行优化研究，实验方案和结果仍需进一步完
4善。
发明内容
本发明提供了一种含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺以及纯化Kringle 5蛋白的工艺。大大提高了 Kringle 5蛋白的表达量。本发明生产工艺简单，回 收率高，并可线性放大到工业规模化生产。
本发明的技术解决方案为
含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺是，其特征在于 设计了 15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15 种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌 生长和目的蛋白表达的培养基；采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了 最佳的发酵工艺；按照摇瓶培养优化后的条件，在micro DCU-400型20L自控 罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40%。 纯化Kringle 5蛋白的两步工艺，其特征在于
(1) 根据Kringle5 DNA序列，设计了从重组质粒pThioA/K5中钓Kringle5 的上下游引物，并在其中分别加入了 Nco I和EcoR I酶切位点，在一定条件下， 通过PCR反应进行Kringle5片段的扩增，扩增产物用1%-2%的琼脂糖电泳检测 后，在一定条件下酶切，再将酶切产物全部进行1%-2%的琼脂糖凝胶电泳，将载 体双酶切片段和Kringle5双酶切片段酶连，所获得的重组质粒pET32a/K5按常 规方法转入BL21 (DE3)后进行培养，重组质粒和重组菌提质粒后均用Nco I和 EcoR I双酶切鉴定后进行序列分析；
(2) 设计了 15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程 菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜 于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基，采用优化后的培养基，通过正交试验， 确定了最佳的发酵工艺，温度大约35-C， pH值6.5-7.0，摇床转速200 r/min-260r/min，接种量8%-10%，诱导剂量0. 6 mmol/L-l. 0 mmol/L，诱导时机为工程 菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。按照摇瓶培养优化后的条件，在micro DCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40%，菌 体浓度通过分光光度计测定OD,而获得，Kringle 5蛋白表达水平的测定用SDS-PAGE电泳法，总蛋白的测定用Bradford方法，葡萄糖浓度的测定用3， 5— 二硝基水杨酸法；
(3) 发酵后离心收集的菌体重悬于A液，A液为加入一定量NaCl的PBS缓 冲液,pH在7.0左右，冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀，沉淀用3-5M左右 的尿素、0. 5%_1.0%左右的Triton X-100和0. 5 -1. 0M的NaCl分别洗涤一次 后，溶于含20-30MPBS的盐酸胍溶液，离心后取澄清液与上清液合并直接上亲 和层析柱，用B液洗脱，等度洗脱，介质选用商品化的亲合层析介质，B液为在 A液中加入一定量的咪唑，收集洗脱峰；
(4) 将收集的洗脱峰直接上阳离子交换层析柱，阳离子交换层析的A液可 选用pH在5. 0左右的HAc-NaAc溶液，B液为在A液中加入0. 3-0. 5M左右的NaCl ， 梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗l 0个柱体积以上，介质 选择商品化的阳离子交换介质，收集阳离子层析后含肿瘤血管生长抑制因子 Kringle 5峰5
(5) 上一步的含有kringle5峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分 别约为98%和95%，脱盐冻干后可得纯肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5。
上述采用阳离子交换层析柱纯化时，A液用HAc-NaAc组成的pH在5. 0左右 的缓冲液，B液为在A液中加入0.3-0.5M左右的NaCl，梯度方式为洗脱液从A 液完全变到B液时，至少冲洗l 0个柱体积以上，介质选择商品化的阳离子交 换介质。
本发明的优点为
大大提高了Kringle 5蛋白的表达量。
生产工艺简单，回收率高，并可线性放大到工业规模化生产。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例中的重组菌BL21 (DE3) pET32a/K5诱导表达的
SDS-PAGE凝胶电泳分析。
1:蛋白marker 2: IPTG诱导后的蛋白电泳图3: IPTG未诱导的蛋白电泳图。图2是本发明实施例中的Kringle 5蛋白在Cu2+络合的S印harose Fast Flow 层析柱上的分离图谱。
具体实施例方式
本发明是在前人工作的基础上，构建了含Kringle 5基因的工程菌，研究 了一种含Kringle 5基因的重组工程菌发酵工艺和一种用亲和层析和阳离子交 换层析纯化Kringle 5蛋白的方法。
本发明的含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺是一--设计了 15种不同的 发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15种培养基中的比生长速 率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌生长和目的蛋白表达的 培养基；采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了最佳的发酵工艺；按照 摇瓶培养优化后的条件，在德国B. Braun公司的micro DCU-400型20L自控罐 中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40%。大大提高了 Kringle 5蛋 白的表达量。
本发明的纯化Kringle 5蛋白的两步工艺是——亲和层析+阳离子交换层 析，以最大限度地縮短提取时间，增大批处理量，提高目标产品的收率，并建 立了一套目标产品纯度和活性检测的标准方法。技术指标为
1. Kringle 5蛋白的表达量达0. 59g/L。
2. Kringle 5蛋白的纯度达96%，活性符合药用。
本发明可在一般的带有梯度洗脱并同时能显示紫外和电导参数装置的高、 中、低层析仪上进行；活性检测用抑制鸡胚绒尿囊膜新生血管生长的试验。 其具体实施方法和步骤如下
1)根据Kringle5 DNA序列，设计了从重组质粒pThioA/K5中钓出Kringle5 的上下游引物，并在其中分别加入了 Nco I和EcoR I酶切位点，在一定条件下， 通过PCR反应进行Kringle5片段的扩增，扩增产物用1%_2%的琼脂糖电泳检测 后，在一定条件下酶切，再将酶切产物全部进行1%_2%的琼脂糖凝胶电泳，将载 体双酶切片段和Kringle5双酶切片段酶连，所获得的重组质粒pET32a/K5按常 规方法转入BL21 (DE3)后进行培养。重组质粒和重组菌提质粒后均用Nco I和 EcoR I双酶切鉴定后进行序列分析。序列分析结果正确；
72) 设计了 15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在 15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程 菌生长和目的蛋白表达的培养基。采用优化后的培养基，通过正交试验，确定 了最佳的发酵工艺，温度大约35。C， pH值6.5-7.0，摇床转速200 r/min-260r/min，接种量8%_10%，诱导剂量0. 6 mmol/L-1. 0 mmol/L，诱导时机为工程 菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。按照摇瓶培养优化后的条件，在德国B. Braun 公司的micro DCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围 大约为40%。菌体浓度通过分光光度计测定OD,而获得，Kringle5蛋白表达水 平的测定用SDS-PAGE电泳法，总蛋白的测定用Bradford方法，葡萄糖浓度的 测定用3， 5—二硝基水杨酸法；
3) 发酵后离心收集的菌体重悬于A液，A液为加入一定量NaCl的PBS缓冲液， pH在7.0左右，冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀。沉淀用3 -5M左右的尿 素、0. 5%-1.0%左右的Triton X-100和0.5 -1. 0M的NaCl分别洗涤一次后， 溶于含20-30M PBS的盐酸胍溶液，离心后取澄清液与上清液合并直接上亲和层 析柱，用B液洗脱，等度洗脱，介质选用商品化的亲合层析介质，B液为在A液 中加入一定量的咪唑，收集洗脱峰；
4) 将收集的洗脱峰直接上阳离子交换层析柱，阳离子交换层析的A液可选 用pH在5. 0左右的HAc-NaAc溶液，B液为在A液中加入0. 3-0. 5M左右的NaCl， 梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗l 0个柱体积以上，介质
选择商品化的阳离子交换介质，收集阳离子层析后含肿瘤血管生长抑制因子 Kringle 5峰；
5) 最后一步的含有Kringle 5的峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度 分别约为98%和95%，脱盐冻干后可得纯肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5。
下面是发明人给出的一个用亲合层析、阳离子交换层析两步法纯化肿瘤血 管生长抑制因子Kringle 5的实例。本发明不限于该实施例。
发酵后离心收集的菌体重悬于A液(20 mmol/L PBS + 0.5 mol/L NaCl, PH7.0)中，冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀并进行SDS-PAGE分析。沉淀 用3 mol/L尿素、1. 0% Triton X-100和0. 5 mol/L NaCl分别洗涤一次后，溶 于含20 ramol/L PBS的7. 0 mol/L盐酸胍溶液，离心后取澄清液与上清液合并直接上已经用A液平衡的层析柱，用5倍柱体积的A液冲洗，再用B液(含25 mmol/L的咪唑的A液)洗脱，收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE分析。 洗出层析图见附图l，峰II为洗脱峰。
将收集到的亲合柱上的峰II上G-25凝胶排阻柱进行脱盐，脱盐后上样于1. 6 X20cm的CM S印harose CL-6B阳离子交换柱上，流速为0. 5ml/min, A液为 20mM HAc-NaAc缓冲液，B液为A液中加0. 6丽aCl，梯度方式为
140min A液
140min-630min B液0-100%
630min-770min B液
洗出层析图见附图2，共出来4个峰，收集各峰做SDS-PAGE电泳。结果表 明，峰III中含有Kringle 5。
最后一步的含有Kringle 5的峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分 别约为98%和95%，脱盐冻干后可得纯肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5。
权利要求
1、含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺是，其特征在于设计了15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基；采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了最佳的发酵工艺；按照摇瓶培养优化后的条件，在micro DCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40％。
2、 纯化Kringle 5蛋白的两步工艺，其特征在于(1) 根据Kringle5DNA序列，设计了从重组质粒pThioA/K5中钓Kringle5 的上下游引物，并在其中分别加入了 Nco I和EcoR I酶切位点，在一定条件下， 通过PCR反应进行Kringle5片段的扩增，扩增产物用1%-2%的琼脂糖电泳检测 后，在一定条件下酶切，再将酶切产物全部进行1%-2%的琼脂糖凝胶电泳，将载 体双酶切片段和Kringle5双酶切片段酶连，所获得的重组质粒pET32a/K5按常 规方法转入BL21 (DE3)后进行培养，重组质粒和重组菌提质粒后均用Nco I和 EcoR I双酶切鉴定后进行序列分析；(2) 设计了 15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程 菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜 于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基，采用优化后的培养基，通过正交试验， 确定了最佳的发酵工艺，温度大约35T:， pH值6.5-7.0，摇床转速200 r/min-260r/min，接种量8%-10%，诱导剂量0. 6 mmol/L-1. 0 mmol/L，诱导时机为工程 菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。按照摇瓶培养优化后的条件，在micro DCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40%，菌 体浓度通过分光光度计测定OD,而获得，Kringle 5蛋白表达水平的测定用 SDS-PAGE电泳法，总蛋白的测定用Bradford方法，葡萄糖浓度的测定用3, 5— 二硝基水杨酸法；(3) 发酵后离心收集的菌体重悬于A液，A液为加入一定量NaCl的PBS缓 冲液，pH在7.0左右，冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀，沉淀用3-5M左右 的尿素、0. 5%-1.0%左右的Triton X-100和0. 5 -1. 0M的NaCl分别洗涤一次 后，溶于含20-30MPBS的盐酸胍溶液，离心后取澄清液与上清液合并直接上亲和层析柱，用B液洗脱，等度洗脱，介质选用商品化的亲合层析介质，B液为在A液中加入一定量的咪唑，收集洗脱峰；(4) 将收集的洗脱峰直接上阳离子交换层析柱，阳离子交换层析的A液可 选用pH在5. 0左右的HAc-NaAc溶液，B液为在A液中加入0. 3-0. 5M左右的NaCl ， 梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗l 0个柱体积以上，介质选择商品化的阳离子交换介质，收集阳离子层析后含肿瘤血管生长抑制因子 Kringle 5峰；(5) 上一步的含有kringle5峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分 别约为98%和95%，脱盐冻干后可得纯肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5。
3、根据权利要求2所述的纯化Kringle 5蛋白的两步工艺，其特征在于 采用阳离子交换层析柱纯化时，A液用HAc-NaAc组成的pH在5. 0左右的缓 冲液，B液为在A液中加入0.3-0.5M左右的NaCl，梯度方式为洗脱液从A液完 全变到B液时，至少冲洗l 0个柱体积以上，介质选择商品化的阳离子交换介 质。
全文摘要
本发明涉及含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺以及纯化Kringle 5蛋白的工艺，确定了适宜于重组工程菌生长和Kringle 5蛋白表达的最佳培养基，通过正交实验方法，对其重组菌的发酵条件进行了优化；并对发酵后的Kringle 5蛋白采用金属亲和层析、阳离子交换层析二步法进行纯化，在带有梯度洗脱并同时能显示紫外和电导参数装置的高、中、低层析仪上进行；活性检测用抑制鸡胚绒尿囊膜新生血管生长的试验。本发明明显提高了Kringle 5蛋白的表达量，可以方便、快速地纯化Kringle 5蛋白，其纯度和生物活性均可达到要用标准。本发明生产工艺简单，回收率高，并可线性放大到工业规模化生产。
文档编号C07K1/00GK101671713SQ20081015087
公开日2010年3月17日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者党红艳, 杨晓燕, 边六交, 超 陈 申请人:陕西北美基因股份有限公司