一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法，包含：步骤1.合成能够在大肠杆菌内高效表达的胸腺素β4基因序列；步骤2.将步骤1所得的基因重组进经SapI酶切的pTWIN1质粒载体，得到pTWIN-Tβ4融合载体；步骤3.以所得的pTWIN-Tβ4为模板，PCR扩增该载体上的内含肽序列以及Tβ4序列；步骤4.将所得的基因序列重组进经NcoI、XhoI酶切的质粒pET-28a中，得到pET-Tβ4表达载体；步骤5.将所得的载体转化至感受态大肠杆菌细胞BL21中，得到pET-Tβ4工程菌；步骤6.在所得菌液的OD600值为0.4-0.6时，加入IPTG诱导Tβ4表达。本发明还公开了该表达胸腺素β4的基因工程菌的应用方法。本发明提供的表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法，为低成本又环保地生产胸腺素β4奠定了基础。
【专利说明】一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因工程菌的制备及应用方法，具体地，涉及一种表达胸腺素β 4的基因工程菌的制备及应用方法。
【背景技术】
[0002]胸腺素β 4 (Thymosin beta 4，T β 4)是由43个氨基酸组成的酸性多肽，N端第一个氨基酸Ser的氨基被乙酰化修饰，无二硫键。其氨基酸序列如下=Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-AIa-GIu-1Ie-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-1Ie-Glu-GIn-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。胸腺素 β4 分子量为 4964Da，等电点为 5.1。
[0003]胸腺素β 4是一种多功能因子，能够调节肌动蛋白的聚合、解聚，在促进皮肤创伤愈合、角膜损伤修复、神经损伤修复、抗炎症、促进组织再生、血管生成及抗细胞凋亡等方面起到重要作用。目前临床应用于皮肤创伤愈合、眼角膜损伤修复、干眼症治疗、心肌损伤修复、神经损伤修复以及化妆品领域(使皮肤年轻化、恢复皮肤的弹性、消除老年斑等)等。
[0004]目前有关胸腺素β4的产品还没上市，临床和研究用胸腺素β 4主要来源于固相合成，这种化学合成方法需要大量的有机试剂，造成的严重环境污染。随着环境的日益污染，政府环评的逐年提高，化学合成方法将被逐步淘汰。此外，固相合成胸腺素β4成本也较高，杂质种类较多。因此，利用基因工程方法生产胸腺素β 4势在必行。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于制备和使用能够表达胸腺素β 4的基因工程菌的方法，通过基因工程方法制备多肽，特别是胸腺素β 4，克服现有技术的不足，为今后低成本又环保地生产胸腺素β4奠定基础。
`[0006]为了达到上述目的，本发明提供了一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备方法，其中，所述的制备方法包含:步骤1，合成能够在大肠杆菌内高效表达的胸腺素β4(Τβ 4)基因序列；步骤2，将步骤I所得的基因重组进经虾碱性磷酸酶I (Sap I)酶切的pTWIN I质粒载体，得到pTWIN-T β 4融合载体；步骤3，以步骤2所得的pTWIN_T β 4为模板，PCR扩增该载体上的内含肽序列以及T β 4序列；步骤4，将步骤3所得的基因序列重组进经限制性内切酶Nco 1、Xho I酶切的质粒pET-28a中，得到ρΕΤ_Τ β 4表达载体；步骤5，将步骤4所得的ρΕΤ-Τ β 4转化至感受态大肠杆菌细胞BL21中，得到ρΕΤ_Τ β 4工程菌；步骤6，在ρΕΤ-Τ β 4工程菌菌液的0D_值为0.4-0.6时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导Τβ 4表达。
[0007]本发明还提供了一种上述方法制备的表达胸腺素β 4的基因工程菌的应用方法，其中，所述的应用方法包含以下步骤:步骤a，将制得的表达T β 4的基因工程菌的菌液进行离心，收集菌体并经超声波破碎，再离心收集上清；步骤b，将所得的上清过镍柱纯化，得到T β 4-内含肽的融合蛋白；步骤C，将纯化后的T β 4-内含肽进行诱导切割，使其释放T β 4，再通过液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)鉴定分子量。
[0008]本发明提供的表达胸腺素β 4的基因工程菌的制备及应用方法具有以下优点:
1、成本低而且环保。由于胸腺素β 4有43个氨基酸，用固相合成成本会比较高，而且环境污染严重。而大肠杆菌表达，氨基酸数量越多，根据化学计量法，质量也越大，产量就会越高，根据我们生产胸腺素α I的成本核算，发酵法生产胸腺素β 4的成本比化学合成的低。
[0009]2、纯化工艺简单，只需一步亲和纯化，就可得到高纯度产物。
[0010]3、真正实现大肠杆菌表达N端乙酰化的胸腺素β 4。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为pTWIN-T β 4工程菌菌落PCR鉴定结果示意图。
[0012]图2为ρΕΤ-Τ β 4工程菌菌落PCR鉴定结果示意图。
[0013]图3为SDS-PAGE鉴定结果示意图。
[0014]图4为液相色谱-质谱联用技术鉴定结果示意图。
【具体实施方式】
[0015]以下结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步地说明。
[0016]本发明提供的表达胸腺素β 4的基因工程菌的制备方法，包含以下步骤:步骤1，合成能够在大肠杆菌内高效表达的胸腺素β4 (Τβ4)基因序列；步骤2，将步骤I所得的基因重组进经虾碱性磷酸酶I (Sap I)酶切的pTWIN I质粒载体，得到pTWIN-T β 4融合载体；步骤3，以步骤2所得的pTWIN-T β 4`为模板，PCR扩增该载体上的内含肽序列以及T β 4序列；步骤4，将步骤3所得的基因序列重组进经限制性内切酶Nco 1、Xho I酶切的质粒pET-28a中，得到ρΕΤ-Τ β 4表达载体；步骤5，将步骤4所得的ρΕΤ_Τ β 4转化至感受态大肠杆菌细胞BL21中，得到ρΕΤ-Τ β 4工程菌；步骤6，在ρΕΤ_Τ β 4工程菌菌液的0D_值为
0.4-0.6时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导T β 4表达。
[0017]本发明还提供了该表达胸腺素β 4的基因工程菌的应用方法，包含以下步骤:步骤a，将制得的表达T β 4的基因工程菌的菌液进行离心，收集菌体并经超声波破碎，再离心收集上清；步骤b，将所得的上清过镍柱纯化，得到T β 4-内含肽的融合蛋白；步骤C，将纯化后的T β 4-内含肽进行诱导切割，使其释放T β 4，再通过液相色谱-质谱联用技术鉴定分子量。
[0018]实施例一:
1、胸腺素β 4基因的获得。
[0019]根据NCBI (ΝΜ_021109.3 )公布的序列及大肠杆菌偏爱密码子，设计能在大肠杆菌内高效表达的胸腺素β 4基因序列，由基因合成公司合成以下两条单链。
[0020]单链1:
TCTGACAAACCCGATATGGCTGAGATCGAGAAATTCGATAAGTCGAAACTGAAGAAGACAGAGACGCAAGAGA
AAAATCCACTGCCTTCCAAAGAAACGATTGAACAGGAGAAGCAAGCAGGCGAATCG。
[0021]单链2:
CGATTCGCCTGCTTGCTTCTCCTGTTCAATCGTTTCTTTGGAAGGCAGTGGATTTTTCTCTTGCGTCTCTGTC
TTCTTCAGTTTCGACTTATCGAATTTCTCGATCTCAGCCATATCGGGTTTGTCAGAo[0022]合成后的两条单链55°C退火30min，得到胸腺素β 4的全基因。
[0023]2、融合载体pTWIN-T β 4的构建。
[0024]将pTWIN I质粒用Sap I酶切，割胶回收。按如下体系将T β 4基因与pTWIN I质粒连接，16°C连接过夜。连接体系如下:
【权利要求】
1.一种表达胸腺素β 4的基因工程菌的制备方法，其特征在于，该制备方法包含: 步骤1，合成能够在大肠杆菌内高效表达的胸腺素β 4基因序列； 步骤2，将步骤I所得的基因重组进经虾碱性磷酸酶I酶切的pTWIN I质粒载体，得到pTWIN-胸腺素β 4融合载体； 步骤3，以步骤2所得的pTWIN-胸腺素β 4为模板，PCR扩增该载体上的内含肽序列以及胸腺素β 4序列； 步骤4，将步骤3所得的基因序列重组进经限制性内切酶Nco 1.Xho I酶切的质粒pET-28a中，得到pET-胸腺素β 4表达载体； 步骤5，将步骤4所得的pET-胸腺素β 4转化至感受态大肠杆菌细胞BL21中，得到PET-胸腺素β 4工程菌； 步骤6，在pET-胸腺素β 4工程菌菌液的0D_值为0.4-0.6时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导胸腺素β4表达。
2.一种根据权利要求1所述的方法制备的表达胸腺素β 4的基因工程菌的应用方法，其特征在于，所述的使用方法包含以下步骤: 步骤a，将制得的表达胸腺素β 4的基因工程菌的菌液进行离心，收集菌体并经超声波破碎，再离心收集上 清； 步骤b，将所得的上清过镍柱纯化，得到胸腺素β4-内含肽的融合蛋白； 步骤c，将纯化后的胸腺素β 4-内含肽进行诱导切割，使其释放胸腺素β 4，再通过液相色谱-质谱联用技术鉴定分子量。
【文档编号】C07K14/575GK103614406SQ201310657618
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】李敏, 陈福鼎 申请人:上海育臣生物工程技术有限公司