专利名称：一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种菌丝霉素基因及其大肠杆菌融合基因工程菌。
背景技术：
Plectasin是2005年Mygind等研究小组通过筛查腐生子囊菌(the saprophytic ascomycetePseudoplectania nigrella)分泌蛋白的cDNA库，从中找出一些与无脊柱动物防御素序列高度相似的片段，并筛选分离出来的首例真菌防御素(其研究结果公布在《自然》杂志上(Nature，2005，437 :975 980))。Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基的肽，由一个信号肽序列(残基1-2 ，一个前片断(残基23-5 和一个40个残基的 C端区域成熟肽(残基56-%)。Plectasin高抗革兰氏阳性菌、无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，在治疗革兰氏阳性菌病方面具有相当大的潜力，是具有治疗潜能的新的肽抗生素。大肠杆菌是常用的重组表达系统，该系统具有遗传背景清晰、基因工程操作方便、 商品化宿主和表达载体种类齐全、表达效率高、成本低、可以快速高密度培养等优点。目前未见大肠杆菌表达菌丝霉素的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于大肠杆菌密码子偏爱性优化的菌丝霉素基因及含有该基因的大肠杆菌基因工程菌。本发明采用如下技术方案，其特征在于该方法包括以下步骤(一 )菌丝霉素基因的设计和合成所述的菌丝霉素基因为编码菌丝霉素成熟肽核苷酸序列，其特征为根据大肠杆菌(Escherichia coli)密码子使用的偏爱性(http//www. kazusa. or. jp/codon/)优化设计，所得菌丝霉素基因具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，通过人工方法直接合成获得。( 二 )重组菌丝霉素表达载体的构建所述的表达载体衍生于pET系列表达载体，优选的，所述的表达载体采用 pET32a(+) ο在菌丝霉素基因的5'-端设计)(a因子的识别切割位点(IEGR)编码序列，用于融合蛋白切割获得重组Plectasin，在其基因两端设计Plectasin基因中不具备但载体多克隆位点上具有的限制性内切酶BamHI和B10I酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，菌丝霉素基因片段经BamHI和B10I双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pET3h(+)上，构建重组表达载体pETPlectasin，经测序验证后保存在大肠杆菌DH5 α 中。(三)重组菌丝霉素大肠杆菌融合基因工程菌的构建
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所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21 (DE3)。重组表达载体pETPlectasin转化经氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE!3)感受态细胞，涂布于LB平板(Amp，100 μ g/mL)，倒置，于37°C培养至出现重组单菌落，菌落 PCR筛选含有plectasin基因的扩增产物片段大小正确的阳性重组大肠杆菌BL21 (DE3) pETPlectasin，该菌株已于2010年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，其保藏号为 CGMCC No. 3563。(四)融合蛋白的诱导表达、柱上切割和重组菌丝霉素的纯化过夜重组菌培养物转接TB培养基，培养至OD6tltl =1.0时，加入0. 4mmol/L IPTG诱导4h，融合蛋白含量能达到53. 6%。重组菌诱导后收集菌体，超声裂解，离心，取上清至亲和柱后，使融合蛋白和Ni-NTAHis-Bind树脂于4°C充分结合lh，流出穿过峰后，采用低浓度咪唑QOmM咪唑)漂洗缓冲液去除杂蛋白，用4倍柱体积的因子酶切缓冲液进行平衡， 加入1倍柱体积的)(a因子酶切缓冲液，按每mL柱材IOU加入所需的酶量，在21°C反应，切割一定时间(约48h)，用4倍柱体积的fe因子酶切缓冲液冲洗获得重组菌丝霉素，经无菌水透析除盐冻干保存。(五)重组菌丝霉素的应用重组菌丝霉素无溶血性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的生长，具有潜在的抗菌药物开发价值。通过附图和实施例对本发明具体实施方式
进行说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
图1.融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE图1 :E. coli BL21 ；2 到 3 :E. coli BL21-pET32a 分别诱导 Oh 和 4h ；4-9 不同诱导时间的诱导结果(0，l，2，4，6，16h)；10 蛋白质 marker (由上至下:94. 0，66. 2，45. 0，28. 5，14. 4kDa)图2. Xa因子柱上切割融合蛋白洗出的重组菌丝霉素的Tricine-SDS-PAGE1 蛋白质 marker (由上至下:94. 0，66. 2，45. 0，28. 5，14. 4kDa)2-7 依次为酶切 0，6，12，24，48和9611样品。图3. Xa因子柱上切割融合蛋白洗出的重组菌丝霉素的MS图4399. 12Da相应于重组肽。图4.菌丝霉素对兔血红细胞的溶血测验结果
具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如“分子克隆实验室手册”(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
本发明的实施例中使用的大肠杆菌BL21(DE3)及pET系列表达载体pET3h(+) 均购自Novagen公司，使用的质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司 (TIANGEN)，使用的限制性内切酶购自NEB公司(New England Biolabs)。实施例1菌丝霉素原核融合基因工程菌的构建1. 1基于大肠杆菌偏爱密码子设计Plectasin的基因根据大肠杆菌(Escherichia coli)密码子使用的偏爱性(http//www. kazusa. or. jp/codon/)优化设计，所得菌丝霉素基因具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。1. 2菌丝霉素原核融合表达载体的构建在菌丝霉素基因的5'-端设计fe因子的识别切割位点(IEGR)编码序列，用于融合蛋白切割获得重组Plectasin，在其基因两端设计Plectasin基因中不具备但载体多克隆位点上具有的限制性内切酶BamHI和BioI酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，菌丝霉素基因片段经BamHI和BioI双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pET3h(+)上，构建重组表达载体pETPlectasin，经测序验证后保存在大肠杆菌DH5 α 中。1. 3 重组表达菌株 Ε. coli BL21 (DE3)pETPlectasin 的构建用氯化钙法制备大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，每100 μ L感受态大肠杆菌细胞，加入重组质粒DNA 1 1(^1^(用量不超过1(^1^，0嫩<50叫)轻轻旋转摇勻，冰浴 30min。将离心管42°C水浴90s。快速将离心管转移至冰浴中，Imin 30s。每管加入800 μ L LB培养基，水浴增温至37°C，然后转移至恒温摇床，37 0C V，转速小于150rpm，保温复苏 45min。将适当体积的已转化细胞(75 μ L)菌悬液，涂布于LB平板(Amp，100 μ g/mL)。倒置，于37°C培养，12 16h出现重组单菌落。菌落PCR筛选含有plectasin基因的扩增产物片段大小正确的阳性重组E. coli BL21(DE3)pETPlectasin。实施例2融合蛋白的诱导表达和重组菌丝霉素的纯化2.1融合蛋白的诱导表达将转化菌落接种于IOmL含有100 μ g/mLAmp的LB培养基中，37°C摇床中震荡培养过夜，以接种量转接到 οομ g/mL Amp的TB培养基中，待菌体生长至对数生长期，0D600 约1. 0时，加入lOOmmol/LIPTG使其终浓度为0. 4mmol/L，30°C诱导不同时间后，5000rpm离心5min，PBS缓冲液(pH 7. 4)洗涤一次，离心收集菌体，SDS-PAGE电泳表明(图1)，菌体蛋白中所表达的蛋白分子量接近预期融合蛋白分子量02.4 kDa)大小，诱导4 h时融合蛋白 Trx-plectasin的表达量达到最高，为细胞总蛋白的53. 6%。2. 2融合蛋白的柱上切割和重组菌丝霉素的纯化重组菌诱导后4h收集菌体，超声裂解，离心，取上清至亲和柱后，使融合蛋白和 Ni-NTAHis-Bind树脂于4°C充分结合lh，流出穿过峰后，采用低浓度咪唑(20mM咪唑)漂洗缓冲液去除杂蛋白，用4倍柱体积的因子酶切缓冲液进行平衡，加入1倍柱体积的fe 因子酶切缓冲液，按每mL柱材10U加入所需的酶量，在21°C反应，切割不同时间，用4倍柱体积的)(a因子酶切缓冲液冲洗获得重组菌丝霉素，图2结果表明在切割他时检测到 plectasin,随着切割时间增长，plectasin量逐渐增大，取融合蛋白柱上切割1 样品的目的蛋白部分进行质谱分析，在目的蛋白部分，其主峰为4399. 12Da，与plectasin的理论分子量4407. 9Da(完全形成二硫键后为4401. 9Da)吻合(图3)。fci因子柱上酶切24h收集的重组菌丝霉素经无菌水透析(透析袋的分子截留量为IkDa)除盐冻干保存。实施例3重组菌丝霉素的活性3. 1重组菌丝霉素的溶血性使用IOmL真空采血管(含有肝素钠作为抗凝剂)在日本长耳白兔的耳边缘静脉采血，IOmM磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.3)重复洗涤细胞三次，然后于4°C，1500rpm，离心 lOmin，至上清无色透明。取180 μ L红细胞IOmM PBS悬浮液(红细胞的浓度大约为2% )， 与20 μ L不同倍比稀释的纯化重组菌丝霉素混合，混合体系在37°C保温30min后，1500rpm 离心5min。取上清转移至96孔板，使用酶标仪在540nm下测定吸光值。溶血百分比0%和 100%的值分别使用IOmM PBS和0. 1% (v/v)Triton X-100在相同条件下同步测定。每个测试做三个平行，取测定值的平均值。结果表明plectasin在1 μ g/mL浓度下不具有抗兔红细胞的溶血性(图4)。3. 2重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌的抑菌实验采用最小抑菌浓度(MIC)实验鉴定重组菌丝霉素的抑菌活性，测试菌金黄色葡萄球菌ATCC 25923采用MHB培养基培养；肺炎链球菌CVCC 2350 (C55962)采用含5%脱脂绵羊血的脑心浸液培养基培养，将纯化的重组菌丝霉素样品用含有0. 01%乙酸溶液中进行倍比稀释，取10 μ L置于96孔板中，每孔加入稀释900倍的0. 5麦氏比浊菌悬液90 μ L，密封后置37°C恒温培养，孵育16 24h判断结果。实验结果表明但在较低的MIC条件下，重组的Plectasin可以有效的抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌(MIC，2y g/mL)和金黄色葡萄球菌(MIC，0.5yg/mL)的生长，在5%的绵羊血清下与万古霉素具有相同抗肺炎链球菌活性。 本发明的重组菌丝霉素可应用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域。表1重组Plectasin抗菌的MIC测定.
权利要求
1.一种菌丝霉素基因，其特征为根据菌丝霉素成熟肽氨基酸序列，按大肠杆菌 (Escherichiacoli)密码子使用的偏爱性(http//www. kazusa. or.jp/codon/)优化设计， 具有如序列表SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列。
2.菌丝霉素原核融合表达载体的构建，其特征在于在如1所述基因的5'-端设计 )(a因子的识别切割位点(IEGR)编码序列，用于融合蛋白切割获得重组Plectasin，在其基因两端设计Plectasin基因中不具备但载体多克隆位点上具有的限制性内切酶Bam HI和 Xho I酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，菌丝霉素基因片段经 Bam HI和Bio I双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pET3h(+)上，构建重组表达载体pETPlectasin，经测序验证后保存在大肠杆菌DH5 α中。
3.融合菌丝霉素基因大肠杆菌的构建，其特征在于重组表达载体pETPlectasin转化经氯化钙法制备大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，涂布于LB平板(Amp，100 μ g/mL)，倒置， 于37°C培养至出现重组单菌落，菌落PCR筛选含有plectasin基因的扩增产物片段大小正确的重组大肠杆菌BL21(DE3)pETPlectasin。
4.如权利3所述的融合菌丝霉素大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)pETPlectasin，该菌株已于2010年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，其保藏号为CGMCC No. 3563。
5.融合蛋白的诱导表达、柱上切割和重组菌丝霉素的纯化，其特征在于过夜重组菌培养物转接TB培养基，培养至OD6tltl= 1.0时，加入0.4mmol/L IPTG诱导4h，融合蛋白含量达到53.6%。重组菌诱导后收集菌体，超声裂解，离心，取上清至亲和柱后，使融合蛋白和 Ni-NTAHis-Bind树脂于4°C充分结合lh，流出穿过峰后，采用低浓度咪唑QOmM咪唑)漂洗缓冲液去除杂蛋白，用4倍柱体积的fe因子酶切缓冲液进行平衡，加入1倍柱体积的fe因子酶切缓冲液，按每mL柱材IOU加入所需的酶量，在21°C反应，切割一定时间(约48h)，用 4倍柱体积的fe因子酶切缓冲液冲洗获得重组菌丝霉素，经无菌水透析除盐冻干保存。
6.重组菌丝霉素无溶血性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的生长，是具有治疗和防治链球菌病潜能的新型抗感染药物。
全文摘要
本发明公开重组菌丝霉素的制备及其应用，按大肠杆菌密码子偏爱性设计的菌丝霉素基因具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，构建重组表达载体pETPlectasin和重组大肠杆菌BL21(DE3)pETPlectasin(CGMCC No.3563)，经IPTG诱导，表达融合蛋白达53.6％。采用Xa因子柱上切割可获得重组菌丝霉素，重组菌丝霉素无溶血性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的生长，是具有治疗和防治链球菌病潜能的新型抗感染药物。
文档编号C07K14/37GK102191256SQ20101011516
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者张军, 杨雅麟, 滕达, 王建华, 田子罡 申请人:中国农业科学院饲料研究所