细胞外基质蛋白的氨基酸序列rgd的特异性人源化抗体及其应用
【专利说明】细胞外基质蛋白的氨基酸序列RGD的特异性人源化抗体及 其应用
[0001] 本申请是申请日为2009年4月24日，题为"细胞外基质蛋白的氨基酸序列R⑶的 特异性人源化抗体及其应用"的中国专利申请200980114376. 2的分案申请。 1.
技术领域
[0002] 本发明涉及免疫特异性地识别细胞外基质蛋白的氨基酸序列RGD (Arg-Gly-Asp) 的人源化抗体（humanized antibody),和该人源化抗体用于治疗和诊断包括癌症、炎症性 疾病、自身免疫病、传染病和骨病等在内的多种疾病或病症的应用。
[0003] 在本临时申请中引用了多个出版物（包括专利和专利申请）。这些出版物的公开 内容通过引用整体并入本临时申请，以更全面地描述本发明所属领域的状态。 2.
【背景技术】
[0004] 细胞粘附在多细胞生物体的生命维持中发挥重要作用。多细胞生物体的细胞粘 附分类为细胞-细胞外基质（下文简称为"ECM"）粘附和细胞-细胞粘附。已经阐明细 胞-ECM粘附由整合素（integrin)介导，细胞-细胞粘附由I丐粘蛋白（cadherin)、封闭蛋白 (claudin)和柄蛋白（nectin)介导。
[0005] 跨膜粘附蛋白（例如整合素）形成细胞-ECM粘附。整合素形成α链和β链的 异源二聚体。目前已经鉴别并确认了至少18种类型的α链，8种类型的β链和24种类 型的α β异源二聚体。各种类型的整合素识别特异的配体。除了细胞粘附外，包括整合素 在内的跨膜粘附蛋白还与从ECM至细胞的细胞内信号传导、增殖调控、移动以及分化有关 (F. G. Giancotti，et. al.，Science, 285, 1028-1032, 1999)。
[0006] 已知许多蛋白都是ECM蛋白，所述ECM蛋白分类为胶原蛋白（例如I-XIX型）、 非胶原糖蛋白（例如骨桥蛋白（osteopontin，OPN))、玻连蛋白（vitronectin)、纤连蛋白 (fibronectin)、血管性血友病因子（von Willebrand Factor)、层粘连蛋白（laminin)、腱 生蛋白（tenascin)、纤维蛋白原（fibrinogen)、血小板反应蛋白（thrombospondin))、弹性 蛋白（elastin)和蛋白聚糖。这些ECM蛋白与相应的整合素结合并激活细胞内信号传导通 路，从而调控细胞骨架形成、移动、增殖和分化等。与ECM蛋白结合的整合素根据ECM蛋白 的类型传递特异信号，由此调控这些信号激活通路。在许多ECM蛋白的细胞粘附区常观察 到RGD序列，该序列通过与整合素结合而具有多种功能。ECM蛋白的RGD序列已经被认为是 可能的药物靶标，并且已经产生了多种小分子化合物和人工肽。
[0007] 已知一些类型的整合素，例如α 3β 1整合素 、α 5β 1整合素 、α 8β 1整合素、 α V β 1整合素 、α V β 3整合素 、α V β 5整合素 、α V β 6整合素 、α V β 8整合素与RGD序列 结合。α 5 β 1整合素与其特异性配体纤连蛋白之间的相互作用激发了对整合素介导的信号 传导机制的研究。所述研究表明，α5β1整合素不仅调控细胞粘附和细胞移动，还调控细 胞分化和细胞死亡。（S. MFrisch et al·，Curr. Opin. Cell Biol. ,9,701-706, 1997)。还 表明，α5β1整合素在肿瘤细胞中高表达，并与癌症的恶性改变有关。各整合素介导的信 号根据所结合的ECM蛋白而不同，例如，生长因子的刺激激活与纤连蛋白结合的内层细胞 的生长，而抑制与层粘连蛋白-1结合的内层细胞的生长。另外，由层粘连蛋白-10/11向 α 3β 1整合素传递的信号不同于由纤连蛋白向α 5β 1整合素传递的信号，前者显著增强 了癌细胞的移动（J· Gu et al.，J. Biol. Chem.，276, 27090-27097, 2001)并通过血液饥饿有 效避免凋亡（J. Gu et al.，J. Biol. Chem.，277, 19922-19928, 2002)。观察到与 α V 整合素 结合的RGD序列在破骨细胞和新生血管中高表达，因此认为抑制RGD序列和α V整合素是 治疗骨质疏松症和癌症的药物的靶标。已经表明，α 5β 1整合素在肿瘤细胞上高表达，并 与癌症的恶性改变有关。根据这些发现，已经开发了抗-α 5 β 1整合素抗体（Volocimab)、 抗-α 4整合素抗体（Natalizumab)和抗-α V β 3整合素抗体（Vitaxin)作为抑制整合素 和ECM蛋白之间相互作用的抗-整合素抗体拮抗药。
[0008] 同时，已知一些ECM蛋白，例如胶原蛋白、骨桥蛋白（OPN)、玻连蛋白、纤连蛋白、血 管性血友病因子、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白包含R⑶序列。另 夕卜，还已知一些病毒和一些细菌具有RGD序列，从而粘附至细胞上。OPN是具有与骨中富含 的钙相结合的性质的酸性糖蛋白。据报道，OPN在细胞粘附、细胞迁移、肿瘤形成、免疫应答 和补体介导的细胞裂解中发挥重要作用。OPN敲除小鼠和抗-OPN中和抗体的结果表明，OPN 与肝炎、自身免疫病（例如类风湿性关节炎）和癌的转移有关。已经指出，抑制ECM蛋白与 细胞结合的抑制剂可用于治疗骨质疏松症或癌症。因此，除了上述靶向整合素的拮抗药外， 还开发了靶向作为整合素结合伴侣的ECM蛋白的拮抗药。
[0009] 3.发明概述
[0010] 虽然已经报道了诸如抑制R⑶序列介导的与整合素的相互作用的小分子、抗OPN 抗体和抗整合素抗体的药物，但还没有关于特异识别RGD序列的抗体的报道。由于RGD序 列是ECM蛋白的保守序列之一，特异识别RGD序列的抗体可在人和治疗性模型动物中均发 挥作用，并因此可以被认为是用于治疗剂开发的非常有用的活性成分。因此，需要特异识别 RGD序列的此类抗体。
[0011] 本发明人之前分离了免疫特异性地识别RGD序列的小鼠单克隆抗体，并通过杂交 瘤克隆33Ε10和35Β6 (保藏编号分别为FERM ΒΡ-10440和FERMBP-10441)产生该抗体。在 本发明中，杂交瘤克隆名称可与由所述克隆产生的单克隆抗体名称互换使用。所有这些小 鼠抗-RGD抗体都为IgGl同型。观察到这些单克隆抗体通过与诸如骨桥蛋白的ECM蛋白的 RGD序列结合而干扰RGD序列介导的ECM和细胞之间的结合。因此，这些抗-RGD抗体对与 RGD序列相关的疾病可具有治疗或诊断作用，所述与RGD序列相关的疾病为，例如癌症，如 癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，如类风湿性关节炎、骨关节炎、传染病、肝炎、支气管 哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎症性肠病（溃疡性结肠炎和克隆 氏病）、自身免疫病、骨质疏松症等。
[0012] 然而，由于这些单克隆抗体都为小鼠源的，由于其免疫原性而可能在人中产生的 不利作用阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗应用。为了降低免疫原性，本发明人制备了 人源化抗体，该人源化抗体具有与人源化抗体所来源的原始小鼠抗-RGD抗体所表现的生 物活性相应的生物活性。
[0013] 因此，本发明提供了免疫特异性地识别RGD序列的人源化抗体或其抗原结合片 段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含部分来源于非人来源和部分来源于人来源的抗 原结合区。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含来源于非人来 源（供体，例如33E10和35B6单克隆抗体）的互补决定区（下文简称为"CDR"）和来源于 人来源（接受体（acceptor))的框架区（下文简称为"FR"）。所述人源化抗体或其抗原结 合片段可抑制RGD序列和其配体之间的结合。
[0014] 在【具体实施方式】中，免疫特异性地识别RGD序列的所述人源化抗体或其抗原结合 片段包含：（i)重链（下文简称为"H-链"），其包含源自人H-链的可变区（下文简称为 "V-区"）的至少一个H-链FR(下文简称为"FRH"），和源自免疫特异性地识别RGD序列的 非人抗体的H-链⑶R(下文简称为"⑶RH"）中的至少一个的至少一个⑶RH;或者（ii)轻 链（下文简称为"L-链"），其包含源自人L-链的V-区的至少一个L-链FR(下文简称为 "FRL"），和源自免疫特异性地识别RGD序列的非人抗体的L-链CDR (下文简称为"CDRL"） 中的至少一个的至少一个⑶RL;或者上述（i)和（ii)两者。在一个实施方式中，所述本发 明的人源化抗体的CDRH中的至少一个和/或CDRL中的至少一个可以源自由选自保藏编号 为FERM BP-10440和FERM BP-10441的杂交瘤产生的单克隆抗体。在优选实施方式中，本 发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：（i)源自人FRH的至少一个FRH，和包含选自氨 基酸序列SEQ ID NO: 1、2和3的氨基酸序列的至少一个⑶RH ;或者（ii)源自人FRL的至 少一个FRL，和包含选自氨基酸序列SEQ ID N0:4、5和6的氨基酸序列的至少一个⑶RL;或 者（iii)上述（i)和（ii)两者。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结 合片段可以包含在CDRHl的SEQ ID NO: 1、在CDRH2的SEQ ID NO:2和在CDRH3的SEQ ID N0:3。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在⑶RLl 的SEQ ID NO: 4、在CDRL2的SEQ ID NO: 5和在CDRL3的SEQ ID NO: 6。优选地，本发明的所 述人源化抗体或其抗原结合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO: 1、在CDRH2的SEQ ID N0:2、 在 CDRH3 的 SEQ ID N0:3、在 CDRLl 的 SEQ ID N0:4、在 CDRL2 的 SEQ ID N0:5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO:6。
[0015] 在一些【具体实施方式】中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含源自由 GenBank登录号X65891 (SEQ ID NO: 13)编码的人H-链的V-区的FRH或者源自由GenBank 登录号X72441(SEQIDN0:18)编码的人κ-L-链的V-区的FRL。在一些实施方式中，本发 明的人源化抗体的FRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO: 14、15、16和17 (分别为X65891的 氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一个氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明 的人源化抗体的FRL包含选自氨基酸序列SEQ ID勵：19、20、21和22(分别为乂72441的氨 基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一个氨基酸序列。在一个最优选的实施方式中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：（i)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24的H-链的 V-区（下文简称为"VH"）；或者（ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26的L-链的V-区（下 文简称为"VL"）上述⑴和（ii)两者。
[0016] 在其它实施方式中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：⑴源自人FRH 的至少一个FRH，和包含选自氨基酸序列SEQ ID N0:7、8和9的氨基酸序列的至少一个 ⑶RH;或者（ii)源自人FRL的至少一个FRL，和包含选自氨基酸序列SEQ ID N0:10、ll和 12的氨基酸序列的至少一个⑶RL ;或者（iii)上述（i)和（ii)两者。在一些实施方式中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含在⑶RHl的SEQ ID N0:7、在⑶RH2的 SEQ ID NO:8和在SEQ ID NO:9的CDRH3。在一些实施方式中，本发明的所述人源化抗体或 其抗原结合片段包含在CDRLl的SEQ ID NO: 10、在CDRL2的SEQ ID NO: 11和在CDRL3的 SEQ ID NO: 12。优选地，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含在⑶RHl的SEQ ID NO: 7、在 CDRH2 的 SEQ ID NO: 8、在 CDRH3 的 SEQ ID NO: 9、在 CDRLl 的 SEQ ID NO: 10、在 CDRL2 的 SEQ ID NO: 11 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO: 12。
[0017] 在一些【具体实施方式】中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含源自由 GenBank登录号X65891 (SEQ ID NO: 13)编码的人H-链的V-区的FRH或者源自由GenBank 登录号X72441(SEQ ID N0:18)编码的人K-L-链的V-区的FRL。在一些实施方式中，本 发明的人源化抗体的FRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO: 14、15、16和17 (分别为X65891 的氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一个氨基酸序列。在一些实施方式中，本发 明的人源化抗体的FRL包含选自氨基酸序列SEQIDN0 :19、20、21和22(分别为X72441 的 氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一个氨基酸序列。在一个最优选的实施方式 中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：（i)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28的VH; 或者（ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL ;或者（iii)上述⑴和（ii)两者。
[0018] 本发明还提供了包含编码免疫特异性地识别RGD序列的本发明人源化抗体或其 抗原结合片段的核苷酸序列的分离的核酸分子。具体而言，本发明提供了分离的核酸分子， 其包含编码包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、7、8和9的至少一个氨基酸序列的人源化H-链的 核苷酸序列，或者包含编码包含选自SEQ ID N0:4、5、6、10、ll和12的至少一个氨基酸序列 的人源化L-链的核苷酸序列，或者包含所述人源化H-链的核苷酸序列和所述人源化L-链 的核苷酸序列两者。在优选的【具体实施方式】中，此分离的核酸分子包含编码VH的核苷酸序 列SEQ ID NO: 23,或者包含编码氨基酸序列SEQ ID NO: 24的核苷酸序列。在一些优选的具 体实施方式中，此分离的核酸分子包含编码VL的核苷酸序列SEQ ID NO: 25,或者包含编码 氨基酸序列SEQ ID NO:26的核苷酸序列。优选地，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序 列SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:25两者。在优选的【具体实施方式】中，本发明的分离的核酸 分子进一步包含编码供体来源的信号肽（例如氨基酸序列SEQ ID NO:32和34)或者异源 来源的信号肽的核苷酸序列。
[0019] 在其它优选的【具体实施方式】中，此分离的核酸分子包含编码VH的核苷酸序列SEQ ID N0:27,或者包含编码氨基酸序列SEQ ID N0:28的核苷酸序列。在一些优选的具体实施 方式中，此分离的核酸分子包含编码VL的核苷酸序列SEQ ID N0:29,或者包含编码氨基酸 序列SEQ ID NO:30的核