一种固相合成比伐芦定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽药物制备方法技术领域，尤其涉及固相合成比伐芦定的方法。
【背景技术】
[0002] 中文名：比伐芦定
[0003] 汉语拼音：Bifaluding
[0004] 英文名称：Bivalirudin
[0005] 药物别名：比瓦尔丁
[0006] 英文别名：Angiomax ;
[0007] 氨基酸序列： D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-Glu -Tyr-Leu-OH
[0008] 化学文摘（CAS)号：128270-60-0
[0009] 分子式：C98Hl38N24〇33
[0010] 分子量：2180. 33
[0011] CAS 名称： D-Phenylalany1-L-proIy1-L-arginyl-L-proIylglycylglycylglycyIglycy1-L-asparaginylglycyl-L-a -aspartyl-L-phenylalanyl-L-a -glutamyl-L-a -gluta myl-L-isoleucyl- L-prolyl-L-α -glutamyl-L-α -glutamyl-L-tyrosyl-L-leucine
[0012] 分子结构式：
【主权项】
1. 一种固相合成法合成比伐芦定的方法，其特征在于，包括如下步骤： 以Fmoc-Leu-载体树脂为起始原料，按照固相偶联合成的方法一次连接具有Fmoc保护 基团的氨基酸，获得保护的二十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用缩合剂进行接肽 反应，获得保护的二十肽树脂后，进行脱侧链保护及裂解，获得比伐芦定粗品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用Fmoc-Leu-载体树脂替代度为： 0.6_L4mmol/g。优选为 0.6_0.8mmol/g。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体树脂选自：Trityl-Cl树脂、 4-Methyltrityl-Cl 树脂、4-Methoxytrityl-Cl 树脂或 2-C1 Trity-Cl 树脂；Wang 树脂或 对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：当载体树脂为Wang树脂时，Fmoc-Leu-OH 与载体树脂偶联的方法为：Fmoc-Leu-OH的羧基与树脂中的羟基在缩合剂的作用下发生偶 联反应而接入保护氨基酸。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：Wang树脂反应前需要溶胀试剂，溶胀试剂 选自N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、二氯甲烷（DCM)、N-甲基吗啡啉（NMM)、二甲基亚砜。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：偶联时需添加缩合试剂和活化试剂， 缩合试剂选自：N，N'_二异丙基碳二亚胺（DIC)、N，N'_二环己基碳二亚胺（DCC)、六氟磷 酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop)、2-(7_偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N' -四 甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)、0-苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲四氟硼酸（TBTU)、N，N-二异丙基乙胺（DIEA)，活化剂选自：1-羟 基苯并三唑（H0BT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（H0AT)中的一种，催化剂为4-二甲氨 基吡啶（DMAP)。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：偶联时所用于溶剂选自：N，N-二甲基甲 酰胺（DMF)、二氯甲烷（DCM)、N-甲基吗啡啉（NMM)、二甲基亚砜（DMS0)中的一种。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的具有Fmoc保护基团的氨基酸分 别为：Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Phe-〇H> Fmoc-Asp (OtBu)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-Gly-〇H> Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：脱侧链保护及裂解使用的酸解试剂选自： 三氟乙酸（TFA)、1，2-乙二硫醇（EDT)的混合溶剂，其用量为每克肽树脂对应5-15mL;酸解 试剂的混合溶剂的配比为：TFA的体积分数为90-95%，EDT的体积分数为5-10%。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤如下： 制备 Fmoc-Leu-Wang 树脂： 将200gWang树脂（100?200目，1. lmmol/g)用800mLDCM浸泡30分钟，抽干。在上述 树脂中，在氮气搅拌的条件下加入DMAP2. 96g、Fmoc-Leu-0H233. 2g(FW:353. 1)、DIC 100mL、 HoBt 90g和DMF 800mL，室温反应8小时；反应结束后抽干溶液，DMF洗涤两次，抽干，加入 吡啶和乙酸酐溶液900mL打封闭，反应4小时；反应结束后抽干溶液，DMF洗涤六次，抽干， 加入甲醇溶液800mL收缩树脂体积6分钟。抽干液体，氮气吹干，获得Fmoc-Leu-Wang树脂 258g〇 封闭后Fmoc-Leu-Wang树脂的替代度为0. 71mmol/g ; 制备侧链全保护比伐芦定肽树脂： Fmoc-Leu-Wang树脂17. 46g，加入DMFlOOmL溶胀30分钟，抽干DMF，加入25 %脱保护试剂150mL，脱保护25分钟，用DMF洗涤六次，抽干，加入用DMFlOOmL溶解的 Fmoc-Tyr(tBu)-〇H 11.4g(FW:459.6)、DIC 3.88mL、HoBt 3.35g的混合物，接肽反应2小 时，反应终点以茚三酮检测阴性为准，抽干，用DMF洗涤两次，抽干，重复以上步骤，按照比 伐芦定肽序逐一与相应的Fmoc保护氨基酸偶联，各Fmoc保护氨基酸的摩尔当量与前述 Fmoc-Tyr (tBu) -0H相同，依次连接的保护氨基酸为： Fmoc-Tyr (tBu)-〇H> Fmoc-Glu (OtBu)-〇H> Fmoc-Glu (OtBu)-〇H> Fmoc-Pr〇-〇H> Fmoc-Ile-OH、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Asn(Trt)-〇H> Fmoc-Gly-Gly-〇H> Fmoc_Gly-Gly-〇H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH 制得侧链全保护比伐芦定肽树脂，其结构如下： NH2-D-Phe-Pr〇-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (0 tBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 树脂； 制备比伐户定粗品： 在 NH2-D-Phe-Pr〇-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe_G lu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 树脂中，加入预 冷至-20°C的裂解试剂（TFA/EDT = 475mL/25mL，体积比），常温裂解反应2小时，减压过滤， 收集滤液，用1500mL乙醚沉淀，减压抽干，获得比伐芦定粗品。
【专利摘要】本发明公开了一种固相合成比伐芦定的方法。本发明的方法包括如下步骤：以Wang树脂为起始原料，合成Fmoc-Leu-载体树脂，在Fmoc-Leu-Wang树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相应的Fmoc-保护氨基酸，得到比伐芦定树脂，接入X片段时，用固相偶联合成反应，X片段对应的Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-OH。本发明的方法避免了工艺杂质比伐芦定[-Gly]、工艺杂质比伐芦定[+Gly]的产生，大大降低了纯化的难度，提高了产品的收率。
【IPC分类】C07K1-06, C07K1-04, C07K14-815
【公开号】CN104530224
【申请号】CN201510005428
【发明人】冷国庆, 杨文龙, 王丽莉, 姚泽宇, 沈清波, 田辉, 张琪, 李迎新
【申请人】哈尔滨吉象隆生物技术有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月7日