恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体的制作方法
【专利说明】恒定链经修饰的双特异性五价和六价I g-M抗体 发明领域
[0001 ]本发明设及具有五聚或六聚结构的结合分子。
[0002] 具体来说，本发明设及具有五聚或六聚环结构的结合分子，其包含五个或六个双 特异性结合单元。在本发明结合分子中，所述双特异性结合单元各自结合两个不同结合祀 标或相同结合祀标上的不同结合区（例如表位），并且所述五个或六个双特异性结合单元各 自具有相同结合特异性(结合至相同的两个结合祀标）。在具体实施方案中，本发明设及具 有五聚或六聚结构的双特异性抗体，其包含五个或六个双特异性结合单元。
[0003] 在不同方面中，本发明包括包含五个或六个单特异性结合单元的结合分子，其中 (i)所述单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至 少包含缀合至结合祀标的结合区的化3和化4域，（ii)至少两个所述单特异性结合单元结合 至不同结合祀标。本发明还包括包含五个或六个双特异性结合单元的结合分子，其中（i)所 述双特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含 缀合至结合祀标的结合区的化3和化4域，并且（i i)至少两个所述双特异性结合单元结合至 不同结合祀标。在具体实施方案中，所述结合分子是多特异性IgM抗体。
【背景技术】
[0004] 由于人源化抗体的出现，诸如民ituxan? (利妥昔单抗（r i tuximab))、Here巧tin? (曲妥珠单抗（trastuzumab))和AvasUn及（贝伐单抗(bevacizumab))的抗体的治疗用途已 使医学领域发生巨大变化，包括肿瘤学、炎症性病症(诸如类风湿性关节炎）的治疗和许多 其他适应症。在美国，超过30种人类或人源化抗体已批准用于临床用途，并且超过600种新 抗体或抗体样分子处于发展的不同阶段。一些抗体对诸如血管内皮生长因子(VEGF)或肿瘤 坏死因子(TNF)的可溶性祀标分子具有括抗功能，它们的作用是疾病的病理性过程的一部 分。或者，抗体可结合、阻断和/或诱导诸如癌症的某些疾病中病理性细胞的破坏。运些治疗 性抗体的主要功能是通过化b区的结合和经由化域的效应子功能的募集(运也介导抗体的 长循环半衰期）。抗体相较于小分子药物的主要优点之一可在于它们的强烈的特异性。抗体 可非常准确地祀向选择的蛋白抗原(诸如癌基因），排除非常相似的同源物，从而允许良性 的安全特性。因此，良好地表征抗体的特异性单一祀向功能。
[0005] 随着领域的进步，抗体功能已得到增强，其通过蛋白质工程的创造性手段诸如提 供较高的亲和力、较长的半衰期和/或较好的组织分布，W及组合小分子和大分子技术来实 现对经由毒性有效载荷递送破坏细胞的提高的关注(例如抗体-药物缀合物）。改良抗体功 能的另一种方法利用免疫球蛋白G(IgG)结构的二价结合，从而允许一个IgG分子结合两个 抗原。事实上，在某些应用中存在不对称抗体通过同时结合两个不同祀标抗原来发挥有用 功能的良好可能性。为了解决运种需要，已产生多种构建体W得到可结合两个不同抗原的 单一分子，从而允许之前从未在自然界中见到的功能。运种双特异性方法的实例是结合分 别在T细胞和B细胞上的CD3和CD19受体的"布利莫单抗(blinatumumabr (MT103)。细胞毒性 T细胞对癌性B细胞的运种束缚允许有效治疗B细胞白血病。
[0006] 但是，在双特异性抗体的构建、表达和产生中仍然存在相当大的技术难度。尽管双 特异性抗体由于它们同时结合两个不同抗原的能力而被视为有前景的治疗剂，但是它们的 实用性由于稳定性和制造复杂性的问题受到限制。
[0007] 各种形式的蛋白质工程改造已用于匹配异源重链，加上重链和轻链的适当成对匹 配，W有效得到双特异性IgG。此外，各种双特异性抗体型式，包括四价体瘤、化学异缀合物、 使用选择的异二聚化域的重组构建体和由两种最小抗原结合位点组成的最小大小的重组 构建体。
[000引但是，所有运些努力都存在困难。
[0009] 因此，除了针对开发双特异性治疗性抗体的努力，仍然存在对开发可引起更有效 并灵活地产生双特异性和多特异性抗体的更有效平台的极大需要，从而使此类治疗剂的发 现与临床引入之间的时间线变短并且实现具有多种特异性和/或化合价的新类型抗体型式 的设计和产生。
【发明内容】
[0010] 本发明设及具有五聚或六聚环结构的结合分子，诸如像具有五个或六个双特异性 结合单元的分离的IgM抗体，W及用于制备和使用所述结合分子的方法和方式。
[0011] 在一个方面中，本发明设及一种具有五聚或六聚环结构的结合分子，其包含五个 或六个双特异性结合单元，其中所述双特异性结合单元各自具有相同的两种结合特异性并 且包含第一链和第二链，所述第一链至少包含与第一结合祀标的第一结合区缀合的IgM重 链恒定区的化4域，所述第二链至少包含IgM重链恒定区的化4域和第二结合祀标的第二结 合区，其中所述第一结合祀标和所述第二结合祀标不同，并且其中所述第一链和所述第二 链经过组装W由于它们个别IgM重链恒定区之间所产生的不对称界面而产生双特异性结合 单元。
[0012] 在一个实施方案中，所述双特异性结合单元是相同的。
[0013] 在另一实施方案中，所述结合分子还包含IgM J链。
[0014] 在又另一实施方案中，所述结合分子具有五聚环结构。
[0015] 在另一实施方案中，所述结合分子具有六聚环结构。
[0016] 在又另一实施方案中，在所述结合分子中，所述第一链和所述第二链还包含IgM重 链恒定区的化3域。
[0017] 在另一实施方案中，所述第一链和所述第二链还包含IgM重链恒定区的化2域。
[0018] 在其他实施方案中，所述第一结合祀标和所述第二结合祀标选自肤、多肤、糖蛋 白、核酸分子W及有机小分子和非有机小分子，包括但不限于可溶性多肤、细胞表面受体、 配体、分子转运蛋白、酶和酶底物。
[0019] 在又另一实施方案中，所述第一结合祀标和所述第二结合祀标是相同可溶性祀标 上的两个位点、相同细胞表面受体祀标上的两个位点、两个不同可溶性祀标、两个细胞表面 受体祀标、一个可溶性祀标和一个细胞表面受体祀标、一个可溶性祀标或细胞表面受体祀 标和一个长停留时间祀标、一个可溶性祀标和一个基质蛋白祀标或底物祀标、一个可溶性 祀标或受体祀标和一个分子转运蛋白祀标，或两个不同细胞类型。
[0020] 将结合区缀合至分子的其余部分可采取融合。因此，例如，第一结合区和第二结合 区可分别融合至第一 IgM重链恒定区和第二IgM重链恒定区的N末端。
[0021] 在具体实施方案中，所述第一结合区和所述第二结合区是抗体的可变区。
[0022] 在另一实施方案中，所述第一结合祀标和所述第二结合祀标是两个不同抗原。
[0023] 在又另一实施方案中，所述第一结合祀标和所述第二结合祀标是相同抗原上的不 同表位。
[0024] 在另外实施方案中，所述第一结合区和所述第二结合区可W是结合至两个结合祀 标或相同结合祀标上的不同表位的两个不同抗体重链可变区。
[0025] 在本发明结合分子中，抗体重链可变区可来自IgG、IgA、I巧和/或IgM抗体，优选来 自IgM抗体。优选地，本文结合分子是双特异性IgM分子，所述分子可(但不需要)还包含与两 个不同IgM重链可变区中的一个缔合的至少一个IgM轻链可变区序列。
[0026] 在具体实施方案中，在本发明结合分子中，在结合单元的两条链的IgM重链恒定区 之间，至少一些不对称界面由盐桥产生，所述盐桥由所述结合单元的两条链的化2、化3和/ 或化4域中的至少一个中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。
[0027] 因此，盐桥可在结合单元的两条链的化2-化2、化4-化4和化2-化3-化4域中的至少 一个之间形成。
[002引在一个实施方案中，成对开关选自由W下组成的组:E一K、K一E; R一E、E一R; D一K、 K一D;和R一D、D一R。
[0029] 在另一实施方案中，结合分子可包含化4-化4域中的至少一个带成对电荷的氨基 酸残基开关，其中开关可例如选自由W下组成的组：R328E，DwE339R，K; R34化，DwS330R，K;1。7化，D^^E3S5R，K.; R427E，D<-->E339民，K;和]-'354E，D<-->I397R.1C。
[0030] 在另一实施方案中，化2-化2域之间的至少一个带成对电荷的氨基酸开关并且可 例如选自由E167R，!<^K177E，D和K16化、D一EI70民，K组成的组。
[0031] 在又另一实施方案中，至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关在化2-化3-化4域 中，并且可例如选自由W下组成的组：DO化，Rw投1姐玉;K150E,D一E385K，民;和 技1縣0玉wD3鄉民氏。
[0032] 在另一实施方案中，在本发明结合分子中，在结合单元的两条链的IgM重链恒定区 之间，至少一些不对称界面通过钮-孔化nobs-into-holes)连接产生，所述钮-孔连接可例 如通过选自由W下组成的组的突变产生:钮:T350一Y，F，W;和册95一Y，F;和孔:L352一G，A， ￥，1，]?，5，1';册95一4，￥，1，1^，]\1，尸，￥;尸393一胖，￥;1397一4，￥，5，1';1350一5,4，￥;和1348一5。
[0033] 在特定实施方案中，在本发明结合分子中，轻链可变区序列（若存在)通过在轻链 与重链之间产生不对称界面来偶联至它们的匹配重链可变区。
[0034] 在其他实施方案中，不对称界面通过CrossMab技术、钮-孔偶联和/或盐桥偶联来 产生。
[0035] 本发明结合分子可包含共同轻链和/或可缀合至毒素或化疗剂。优选地，缀合是通 过融合，但通过化学连接子的缀合也包括在本发明范围内。
[0036] 本文结合分子可W是具有五聚或六聚结构的双特异性抗体，所述抗体可W是嵌合 的或人源化的。
[0037] 在不同方面中，本发明设及一种组合物，其包含至少约70%、或至少80%、或至少 90%或至少95%、至少98%、或至少99%如上文中定义的结合分子。
[0038] 在具体实施方案中，组合物是药物组合物。
[0039] 本发明进一步设及一种具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，其包含五个 或六个单特异性结合单元，其中（i )所述单特异性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区， 其各自至少包含缀合至结合祀标的结合区的化3和化4域，（ii)至少两个所述单特异性结合 单元结合至不同结合祀标，并且（iii)外部不对称界面在结合至不同结合祀标的邻近单特 异性结合单元的重链恒定区之间产生。
[0040] 在一个实施方案中，至少=个所述单特异性结合单元结合至不同结合祀标。
[0041] 在另一实施方案中，至少四个所述单特异性结合单元结合至不同结合祀标。
[0042] 在又另一实施方案中，结合分子具有五聚环结构并且所有五个单特异性结合单元 结合至不同祀标。
[0043] 在另一实施方案中，结合分子具有六聚环结构并且至少五个所述单特异性结合单 元结合至不同祀标。
[0044] 在又另一实施方案中，所有六个单特异性结合单元结合至不同祀标。
[0045] 在另一方面中，本发明设及一种具有五聚或六聚环结构的多特异性结合分子，其 包含五个或六个双特异性结合单元，其中（i)所述双特异性结合单元各自包含两个IgM重链 恒定区，其各自至少包含缀合至结合祀标的结合区的化3和化4域，（ii)至少两个双特异性 结合单元结合至不同结合祀标，（i i i)内部不对称界面在各双特异性结合单元的两个IgM重 链恒定区之间产生，并且（iv)外部不对称界面在结合至不同祀标的邻近双特异性结合单元 的重链恒定区之间产生。
[0046] 在一个实施方案中，至少=个所述双特异性结合单元结合至不同结合祀标。
[0047] 在另一实施方案中，至少四个所述双特异性结合单元结合至不同结合祀标。
[0048] 在又另一实施方案中，结合分子具有五聚环结构并且所有五个双特异性结合单元 结合至不同祀标。
[0049] 在另一实施方案中，结合分子具有六聚环结构并且至少五个所述双特异性结合单 元结合至不同祀标。
[0050] 在又另一实施方案中，所有六个双特异性结合单元结合至不同祀标。
[0051] 在不同实施方案中，多特异性结合分子还包含IgM J链。
[0052] 在各种实施方案中，多特异性结合分子可具有五聚或六聚环结构。
[0053] 不管本发明多特异性结合分子的结合特异性的数目和性质，W下特定实施方案适 用：
[0054] 在一个实施方案中，在至少一个结合单元中，IgM重链恒定区还包含化2域。在又另 一实施方案中，在所有结合单元中，IgM重链恒定区还包含化2域。在各种实施方案中，本发 明多特异性结合分子可结合至选自W下的结合祀标:肤、多肤、糖蛋白、核酸分子W及有机 小分子和无机小分子。
[0055] 在其他实施方案中，本发明多特异性结合分子结合至选自W下的结合祀标:可溶 性多肤、细胞表面受体、配体、分子转运蛋白、酶和酶底物。
[0056] 在另外实施方案中，结合至不同祀标的本发明多特异性结合分子选自由结合至W 下的结合单元组成的组:相同可溶性祀标上的位点；相同细胞表面受体祀标上的位点；不同 可溶性祀标;不同细胞表面受体祀标;可溶性祀标和细胞表面受体祀标;可溶性祀标或细胞 表面受体祀标和长停留时间祀标;可溶性祀标和基质蛋白祀标或底物祀标;可溶性祀标或 受体祀标和分子转运蛋白祀标，和不同细胞类型。
[0057] 在具体实施方案中，在本发明结合分子内的结合单元中，IgM重链恒定区与结合祀 标的结合区之间的缀合是通过融合。因此，例如，结合区可融合至IgM重链恒定区的N末端。
[0058] 在一个实施方案中，至少一个结合区是抗体的可变区。
[0059] 在另一实施方案中，所有结合区是抗体重链可变区。
[0060] 在又另一实施方案中，至少两个结合祀标是不同抗原。
[0061] 在又另一实施方案中，至少两个结合祀标是相同抗原上的不同表位。
[0062] 在所有方面和实施方案中，抗体重链可变区可来自IgG、IgA、I姐或IgM抗体，优选 来自IgM抗体。
[0063] 在优选实施方案中，本发明多特异性结合分子是多特异性IgM抗体。
[0064] 在一个实施方案中，本发明多特异性IgM抗体还包含与至少一个结合单元中的IgM 重链可变区缔合的至少一个IgM轻链可变区序列。
[0065] 在另一实施方案中，多特异性IgM抗体还包含与IgM重链可变区中的每一个缔合的 IgM轻链可变区序列。
[0066] 在所有方面和实施方案中，外部不对称界面通过化3域内的变化产生。在一个实施 方案中，变化由盐桥产生，所述盐桥由化3域中带相反电荷的氨基酸残基之间的成对开关形 成。
[0067] 在各种实施方案中，提供外部不对称界面的盐桥由化3-化3域中至少一个带成对 电荷的氨基酸残基开关形成，所述氨基酸残基开关可例如是邻近y链中的1C238 D293或 K268 <-? D294.
[0068] 在所有方面和实施方案中，在本发明多特异性结合分子(例如多特异性IgM抗体） 中，内部不对称界面由盐桥产生，所述盐桥由化2、化3和/或化4域中的至少一个中带相反电 荷的氨基酸残基之间的成对开关形成。
[0069] 在一个实施方案中，盐桥在所述结合单元的两条链的化2-化2、化4-化4和化2-化 3-化4域中的至少一个之间形成。
[0070] 在另一实施方案中，成对开关选自由W下组成的组:E一K、K一E; R一E、E一R; D一K、 K一D;和R一D、D一R。
[0071] 在另一实施方案中，多特异性结合分子，例如多特异性IgM抗体，包含化4-化4域中 至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关，所述开关可例如选自由W下组成的组： R32化，DwE339R乂； RM化，[>-*S330民，K; K巧化，DwE385R,K;及427E，D一E339R，K;和 T354E,Dwl397R,K，
[0072] 在又另一实施方案中，多特异性结合分子，例如多特异性IgM抗体，包含化2-化2域 之间至少一个带成对电荷的氨基酸开关，所述开关可例如选自由E167氏区一财77E，D和 区1猫E，r)4；E巧腿糸组成的组。
[0073] 在另一实施方案中，多特异性结合分子，例如多特异性IgM抗体，包含化2-化3-化4 域中至少一个带成对电荷的氨基酸残基开关，所述开关可例如选自由W下组成的组： D1211<，民<一1<3 i 5D，E ; K150E，D一E;;85K，R;和 K185D，E一D360K，R。
[0074] 在所有方面和实施方案中，IgM重链恒定区之间的至少一些外部不对称界面和/或 内部不对称界面可通过钮-孔连接产生。例如，至少一个钮-孔连接由选自由W下组成的组 的突变产生:钮:T350一Y，F，W;和册95一 Y，F;和孔:L352一 G，A，V，I，M，S，T;H395^A，V，I，L, M，F，Y;F393一W，Y;I397一A，V，S，T;T350一S，A，V;和T348一S。
[0075] 在包含轻链可变区序列的多特异性IgM抗体中，此类轻链可变区序列可通过在轻 链与重链之间产生不对称界面来偶联至它们的匹配重链可变区。在各种实施方案中，不对 称界面可通过CrossMab技术、钮-孔偶联和/或盐桥偶联来产生。在另一实施方案中，多特异 性结合分子的结合单元包含共同轻链。
[0076] 在所有方面和实施方案中，多特异性结合分子可缀合至毒素或化疗剂，其中缀合 可例如通过融合和/或通过化学连接子。
[0077] 本发明多特异性IgM抗体可W是嵌合的或人源化的。
[0078] 在另一方面中，本发明设及一种组合物，其包含至少约70%、或至少约80%、或至 少约90%、或至少约95%、或至少约98%、或至少约99%本文的多特异性结合分子。所述组 合物可例如是包含至少一种药学上可接受的成分的药物组合物。
【附图说明】
[0079] 图1说明包含J链的IgM五聚体的结构，其中链A和B在天然IgM中是相同的。
[0080] 图2A说明具有两种结合特异性的五元IgM分子，其中指定为A和B的重(ii)链是不同 的。
[0081] 图2B说明包含五个或六个单特异性结合单元的多特异性IgM抗体，其中（i)单特异 性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结 合祀标的结合区的化4域，（i i)至少两个单特异性结合单元结合至不同结合祀标。
[0082] 图2C说明包含五个或六个双特异性结合单元的多特异性IgM抗体，其中（i)双特异 性结合单元各自包含两个IgM重链恒定区，所述两个IgM重链恒定区各自至少包含缀合至结 合祀标的结合区的化4域，并且（ii)至少两个双特异性结合单元结合至不同结合祀标。
[0083] 图3为如Czajkowsky D.M，化曰〇 Z,PNAS 2009; 106:14960-14965中公开的IgM分子 的A重链和B重链的结构模型。
[0084] 图4A示出人类IgGU I巧和IgM的分别CGUCEl和CMl恒定域的比对。
[0085] 图4B示出人类I巧和I gM的分别CE2和CM2恒定域的比对。
[0086] 图4C示出人类IgGU I巧和IgM的分别CG2、CE3和CM3恒定域的比对。
[0087] 图4D示出人类IgG、I巧和IgM的分别CG3、CE4和CM4恒定域的比对。
[008引在图4A至4D中：
[0089] 人类I巧序列来自GenBank J00222.1;残基编号来自PDB 2WQR;螺旋化)和折叠（S) 分配来自PDB