检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统的制作方法

检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统的制作方法
【专利说明】检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求对2013年3月14提交的美国临时专利申请系列第61/782, 003号（其 公开内容通过引用整体并入本文）的提交日期的优先权。
[0003] 背景
[0004] 每年世界上进行100,000多例实体器官移植，包括每年在美国进行的数万例移 植。尽管在免疫抑制和移植后护理方面取决了显著的改善，但长期的移植物功能不太理想。 在美国，死亡和活供体的肾移植物的经调整的10年异体移植物存活率分别仅为约40%和 60%。继发于抗体介导的排斥（AMR)的早期和晚期移植失败是低移植物存活率的重要原 因。
[0005] 针对人白细胞抗原（HLA)的抗体是存在于移植候选者或受体的血液中的循环抗 体，其为较早致敏事件（输血、先前的移植或妊娠）的结果。移植前存在的供体特异性抗体 (DSA)可引起超急性排斥和立即移植物失功，并且可通过移植前交叉配血来评估。在最近几 年，监测针对供体特异性HLA-I类和II类错配的临床相关抗体的移植后发生的概念一直是 移植界内关注的重要领域。无论在移植前还是移植后检测，当未进行临床治疗时，针对在供 体器官上表达的抗原的抗体的存在都导致对移植器官的免疫攻击，并且增加移植物失功和 /或排斥的风险。DSA攻击，除其它以外，异体移植物的内皮，并且可导致随后活组织检查证 明的AMR以及需要增强的免疫抑制的急性损伤。DSA发展的进展和相应的临床事件一起损 害异体移植物，从而随着时间的推移导致慢性改变，最终削弱移植物功能和存活。
[0006] 抗体介导的排斥可表现为因记忆应答或从头抗原体产生而导致的早期急性过程， 或表现为因从头抗体产生而引起的晚期和慢性过程。在急性期中，通常预先形成导致早期 急性排斥的抗体，但从头DSA也可在早期移植后期间发生，从而导致急性排斥。具有预先形 成的DSA的患者处于显著更大的患有急性AMR的风险中，并且具有显著更低的移植物存活 率。
[0007] 慢性排应是移植肾失功能（death-censored graft loss)的主要原因之一。同种 抗体介导的损伤和修复的反复循环导致异体移植物的微血管系统的显著变化。具有预先形 成的DSA的患者和从头发生DSA的患者处于增加的患有慢性排斥的风险中。
[0008] 概述
[0009] 提供了用于测定供体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在的方法。所述方法 包括通过在足以使受体免疫抗体（如果存在的话）结合供体细胞表面抗原（Ag)的条件下 将来自供体的细胞样本与来自受体的生物样本组合来形成混合物以形成免疫抗体-Ag复 合物，将所述混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物（例如，Ag或免疫 抗原）的珠粒混合，在裂解条件下添加特异性结合结合于珠粒的免疫抗体-Ag复合物的可 检测地标记的抗体，和检测结合于免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在或不 存在，以测定供体特异性抗体在来自受体的生物样本中的存在或不存在。还提供了用于实 施主题方法的系统和试剂盒。
[0010] 附图简述
[0011] 当结合附图阅读时，可根据下列详细描述最好地理解本发明。包括在附图中的是 下列图：
[0012] 图1示意性举例说明用于据本公开内容的一个实施方案测定供体特异性抗体在 生物样本中的存在或不存在的方法。
[0013] 图2示意性举例说明用于根据本公开内容的第二实施方案测定供体特异性抗体 在生物样本中的存在或不存在的方法。
[0014] 图3显示包括同时捕获和标记DSA的DSA-FXM实验的结果。使用区别在于每一个 珠粒的内部荧光ID的HLA-I类和II类珠粒，通过DSA-FXM测试4个样本。因 HLA特异性 抗体而增强荧光（阳性信号）示于X轴上。图3,图A :HLA-I类（C-I)和II类（C-II)供 体特异性抗体（DSA)呈阴性（CI-/CII-);图3,图B :仅C-II DSA呈阳性（CI-/CII+);图3， 图 C :仅 C-I DSA 呈阳性（CI+/CII-);和图 3,图 D :CI 和 C-II DSA 都呈阳性（CI+/CII+)。
[0015] 图4显示包括相继捕获和和标记DSA的DSA-FXM实验的结果。通过DSA-FXM测试 阴性AB血清（样本A)和三个阳性血清（样本B、C和D)。样本A :C-I和C-II DSA呈阴性； 样本B :C-I和C-II DSA呈阳性；样本C :仅C-I DSA呈阳性并且C-II DSA呈阴性；样本D : 仅C-II DSA呈阳性并且C-I DSA呈阴性。
[0016] 图5提供DSA-FXM实验的结果。通过FXM、DSA-FXM和LMX-IgG针对不同细胞数目 测试以不同稀释度存在的HLA-Ab阳性血清（PPS)的混合物。结果显示DSA-FXM是用于检测 DSA的最灵敏的方法并且当与标准方法相比较时使用少得多的细胞（例如可用少至25, 000 个细胞来检测DSA)。LMX-IgG在使用单抗原珠粒的Luminex平台上确定了 PPS血清中包含 的HLA特异性并且显示的值是平均荧光强度（MFI)。大于或等于1000MFI的值被认为是阳 性的；500-999MFI的值被认为可能是阳性的（不明确的）。
[0017] 图6显示DSA-FXM实验的结果。通过DSA-FXM，同时利用盲攻击和并行地利用定期 流式细胞交叉配型（FXM)和在单抗原珠粒上进行的标准Luminex抗体筛选（LMX-IgG)来测 试23个CAP(美国病理学家学会）外部能力样本。鉴定HLA-I类（C-I)和/SHLA-II(C-II) 的供体特异性抗体（DSA)，并通过LMX-IgG进一步确认大多数DSA。一些具有低MCS的额外 DSA只能用更灵敏的DSA-FXM方法检测到。外部能力样本是具有已知的特异性的血清和细 胞。在从所有参与中心接收所有结果之前，血清的特异性对于参与者是未知的。
[0018] 图7提供DSA-FXM实验的结果。7个HLA-DQ DSA阳性样本已被LMX-IgG鉴定，并 且已被DSA-FXM确认。历史上，一直不可能通过任何类型的牵涉细胞或细胞提取物的DSA 测定将所有特异性DSA检测成DQ。
[0019] 图8显示DSA-FXM实验的结果。6个HLA-DP DSA阳性样本已被LMX-IgG鉴定，并 且已被DSA-FXM确认。
[0020] 图9提供DSA-FXM实验的结果。3个HLA-C DSA阳性样本已被LMX-IgG鉴定，并且 已被DSA-FXM确认。
[0021] 图10显示来自DSA-FXM测试法的实验性结果。图A :HLA-I类（C-I)和II类（C-II) 供体特异性抗体（DSA)呈阴性（CI-/CII-);图B :仅C-I DSA呈阳性（CI+/CII-);图C :仅 C-II DSA 呈阳性（CI-/CII+);和图 D :CI 和 C-II DSA 呈阳性（CI+/CII+)。
[0022] 图11提供117个利用已知的I类和II类DSA反应性或缺乏其的单独的DSA-FXM 测试的结果，该结果显示与已知的DSA特征谱相关的反应性的互斥模型。
[0023] 图12显示针对I类特异性DSA (B7)的FXM、DSA-FXM和LMX-IgG单抗原珠粒测定 的灵敏度比较，该比较显示即使当另两个测试是阴性时，DSA-FXM亦可检测靶细胞上的特异 性 HLA I 类 DSA。
[0024] 图13显示针对II类特异性DSA(DR4)的FXM、DSA-FXM和LMX-IgG单抗原珠粒测 定的灵敏度比较，该比较显示即使当另两个测试是阴性时，DSA-FXM亦可检测到靶细胞上的 特异性HLA II类DSA。
[0025] 图14的图A和B显示针对95个I类DSA(图A)和100个II类DSA(图B)的FXM 比较的DSA-FXM与LMX-IgG SAB结果之间的皮尔逊相关。图C显示使用IgG DSA作为标准 的针对I类和II类的灵敏度和特异度百分比。图D显示针对7个血清样本出个个体）的 LMX-IgG SAB、LMX-Clq SAB、FXM和DSA-FXM的比较。与LMX-SAB的过度反应性相关的差异。 结合图15,结果显示LMX-IgG SAB给出假阳性反应（即，当FXM和DSA-FXM为阴性时DSA呈 阳性）。这促成了图15中显示的较低的特异度。
[0026] 图15显示针对15个患者的FXM与DSA-FXM的比较，所述患者中有12个通过FXM 测定具有未知特异度的针对抗原的自体抗体（下图）。这些患者中有4个（P12-P-15)具有 针对HLA的自体抗体，如通过DSA-FXM测定的（上图）。
[0027] 图16显示FXM与DSA-FXM区分因 DSA种类（I和/或II)而引起的阳性反应的能 力的比较。DSA-FXMCI珠粒检测所有I类，CIIa检测DQ，CIIb检测所有DR和DP，但 仅检测某些DQ。显示了 4个不同类型的结果。1和3类都具有阳性B细胞FXM，但案例1归 因于I类同种抗体，然而案例3归因于II类同种抗体。案例2和4都具有阳性T和B FXM， 但案例2归因于自体抗体，然而案例4归因于I类同种抗体。
[0028] 图17的图A显示针对在缓冲液中1:2稀释的和在静脉注射免疫球蛋白（IVIG)中 1:2稀释的血清中的I类DSA的DSA-FXM结果。IVIG用于对HLA脱敏，降低抗体。常规FXM 显示因第二步骤抗-IgG试剂和IVIG与细胞表面上的未知靶的广泛反应性的存在而导致的 IVIG处理的样本相较于缓冲液（数据未显示）的增加。DSA-FXM显示IVIG的抑制，因为检 测对于HLA是特异的。因此，DSA-FXM显示处理的功效。图B显示针对在缓冲液中1:2稀 释的和在静脉注射免疫球蛋白（IVIG)中1:2稀释的血清中的II类DSA的DSA-FXM结果。 IVIG用于对HLA脱敏，降低抗体。常规FXM显示因第二步骤抗-IgG试剂和IVIG与细胞表 面上的未知靶的广泛反应性的存在而导致的IVIG处理的样本相较于缓冲液（数据未显示） 的增加。DSA-FXM显示IVIG的抑制，因为检测对于HLA是特异的。因此，DSA-FXM显示处理 的功效。
[0029] 图18的图A显示掺有5% IVIG并在不同稀释度上通过DSA-FXM测试的阳性DSA 血清的结果。结果显示IVIG对HLA I类DSA具有剂量依赖性抑制。图B显示掺有5% IVIG 并且在不同稀释度上通过DSA-FXM测试的阳性DSA血清的结果。结果显示IVIG对两种HLA II类DSA具有剂量依赖性抑制。
[0030] 图19显示关于来自经历IVIG脱敏处理以前瞻性地降低/消除鉴定的潜在活供体 的DSA的肾候选者的系列样本的FXM和DSA-FXM结果。FXM结果显示因 IVIG和Rituxan (治 疗性抗-CD20，B细胞的标志物）而引起的增加的MCS值，而DSA-FXM结果在即使在治疗性抗 体存在的情况下亦显示在对于移植是可接受的范围内的对IVIG和MCS值的抑制（功效）。
[0031] 定义
[0032] "供体特异性抗体"或"DSA"意指存在于受体中的特异性结合供体抗原（例如，供 体细胞表面抗原）的抗体。DSA可以是"预先形成的"（例如，在接受来自供体的移植物或 输血之前存在于受体中）和/或从头产生的DSA(其由受体响应已怀孕或接受来自一个或 多个供体的移植物或输血而产生）。在一些情况下，DSA可以是结合患者自己细胞的细胞表 面组分的自体DSA (自体抗体）。在某些方面，DSA是补体结合抗体（CFAb)。在某些方面， DSA是针对HLA抗原的。
[0033] 主题发明的"亲和试剂"具有对靶分析物具有高结合亲和力的分析物结合结构 域、部分或组分。高亲和力意指至少约10 4M,通常至少约10 6M或更高，例如10 9M或更高的 结合亲和力。亲和试剂可以是多种不同种类的分子的任一种，只要其当以标记的亲和配体 形式存在时展现对于靶蛋白的必要结合亲和力即可。
[0034] 这样，亲和试剂可以是小分子或大分子配体。小分子配体意指大小范围在约50至 约10, 000道尔顿，通常地约50至约5, 000道尔顿，更通常地约100至约1000道尔顿内的 配体。大分子意指大小在分子量上为约10, 〇〇〇道尔顿或更大的配体。
[0035] 特别吸引人的是大分子亲和配体是抗体以及其结合片段和模拟物。当抗体是亲和 配体时