任何方便的时间量同时进行混合、接触和检测步骤。根据某些实施方案，在12 小时或更短，诸如11小时或更短，10小时或更短，9小时或更短，8小时或更短，7小时或更 短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短，3小时或更短，2小时或更短的时间内进行本 公开内容的方法。
[0078] 根据某些实施方案，本公开内容的方法包括生成表明供体特异性抗体是否存在于 来自受体的生物样本中的报告。如果DSA存在，则所述报告可包括关于来自受体的生物样 本中的DSA的量的信息。报告可通过计算机生成，在该情况下任选地将报导显示于计算机 的远程输出设备。
[0079] 在某些实施方案中，本公开内容的方法用于检测结合存在于来自供体的细胞样本 中的细胞上的供体HLA抗原（例如，HLA I类和/或HLA II类抗原）的DSA。根据一个实 施方案中，通过将包括含有HLA抗原的供体细胞的细胞样本与来自受体的血清或血浆接触 (以使能够特异性结合供体HLA的任何DSA可结合于供体HLA)来形成混合物。可在接触 步骤之前，洗涤所得的含有DSA-HLA复合物的混合物1次或多次（例如，3次）。根据该实 施方案中，接触步骤包括添加涂覆有抗-HLA抗体的微珠，以使附接于珠粒的抗-HLA抗体结 合于供体细胞表面上的供体HLA I类和/或II类分子的恒定区。可洗涤现包括结合于供 体HLA抗原的捕获珠粒的所得复合物1次或多次（例如，3次），随后继续进行所述方法。 根据该实施方案，在裂解条件下添加荧光标记的抗-IgG抗体（例如，PE-抗-IgG抗体）， 以使抗-IgG抗体结合复合物的DSA。供体细胞的裂解有利于复合物与存在于复合物中的 其它材料分离。随后，可检测来自荧光标记的抗-IgG抗体的荧光，任选地定量所述荧光，以 测定DSA在结合供体HLA的受体血清或血浆中的存在（和任选地量/浓度）或不存在。在 某些方面，所述方法用于查询受体血清/血浆的DSA的存在或不存在，所述DSA结合HLA I 类和 / 或 II 类例如 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、 HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DPA 和 HLA-DPB。
[0080] 根据本公开内容的实施方案的方法在图1中进行了示意性举例说明。根据该实 施方案，通过流式细胞仪或Luminex器检测免疫抗体-Ag复合物。在反应中，将供体细胞 与受体血清组合。供体特异性抗体（DSA)(如果存在的话）特异性结合供体细胞上的抗原 (Ag)以形成DSA-Ag复合物。在裂解条件下，通过缀合有针对与DSA-Ag复合物中相同的Ag 的抗体的珠粒特异性捕获DSA-Ag复合物。利用荧光标记的第二抗体，通过流式细胞仪或 Luminex器检测捕获的DSA-Ag。
[0081] 根据本公开内容的第二实施方案的方法在图2中进行了示意性举例说明。根据该 实施方案，通过酶联免疫吸附测定（ELISA)来检测免疫抗体-Ag复合物。在反应中，将供体 细胞与受体血清组合。供体特异性抗体（DSA)(如果存在的话）特异性结合供体细胞上的 抗原（Ag)以形成DSA-Ag复合物。在细胞裂解后，DSA-Ag复合物通过针对与DSA-Ag复合物 中相同的Ag的抗体被特异性捕获在基底上。连接有第二抗-IgG抗体的酶结合DSA，并且在 酶与底物反应时DSA是可检测的。本公开内容还提供了该方法的变型（例如，发光测定）。
[0082] MM
[0083] 还提供了用于进行本公开内容的方法的系统。本公开内容的系统包括样本流体 系统，其包括处理器和可操作地连接于处理器的在其上具有存储的编制程序的计算机可读 介质。当通过处理器执行时，所述存储的编制程序使处理器按程序，通过在足以使受体免 疫抗体（如果有的话）结合供体细胞表面抗原（Ag)的条件下将来自供体的细胞样本与来 自受体的生物样本组合来形成混合物以形成免疫抗体-Ag复合物。当通过处理器执行时， 所述存储的编制程序还使处理器按照程序，将混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗 体-Ag复合物的抗体的珠粒接触，和在裂解条件下添加特异性结合免疫抗体-Ag复合物的 可检测地标记的抗体。主题系统还包括被构造来测定样本的结合于免疫抗体-Ag复合物的 可检测地标记的抗体的存在或不存在，以测定供体特异性抗体的存在或不存在。在某些方 面，将流式细胞仪以流控方式偶联于样本流体子系统。
[0084] 处理器可以是用于报告存储的编制程序的任何适当的处理器。根据某些实施方 案，处理器按程序在子系统将混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的 抗体的珠粒接触之前，使样本流体子系统洗涤混合物。可选地，或另外地，处理器可按程序 在子系统将混合物与包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的抗体的珠粒接触之后，但在流 式细胞仪测定样本的结合于复合物的可检测的标记的存在或不存在之前，使样本流体子系 统洗涤混合物。
[0085] 计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或计算机可读存储介质。计算机可 读存储介质可以是，例如，但不限于电子、磁性、光学、电磁、红外线或半导体系统、装置或设 备，或上述的任何适当组合。计算机可读存储介质的更具体实例（非穷举列表）可包括下 列实例：具有一个或多个导线电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器（RAM)、只 读存储器（R0M)、可擦除可编程只读存储器（EPROM或闪存）、光纤、便携式光盘只读存储器 (CD-ROM)、光存储设备、磁存储设备或上述的任何适当的组合。计算机可读存储介质可以是 任何有形介质，所述介质可含有或存储由本公开内容的系统的样本流体子系统使用的或与 所述样本流体子系统结合使用的程序。
[0086] 来自供体的细胞样本、供体细胞表面抗原、来自受体的生物样本、受体免疫抗体 (例如，抗-HLA DSA)、在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的抗体的珠粒、可检 测地标记的抗体、缓冲液、结合和裂解条件以及流式细胞仪可以是如上文中针对本公开内 容的方法所描述的。
[0087] 本公开内容的系统可被构造来在方便的时间量中检测DSA的存在或不存在。根据 某些实施方案，主题系统被构造来在12小时或更短，诸如11小时或更短，10小时或更短，9 小时或更短，8小时或更短，7小时或更短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短，3小 时或更短，2小时或更短的时间内检测DSA在受体的生物样本中的存在或不存在。
[0088] 试剂盒
[0089] 还提供了包括用于进行本公开内容的方法的一种或多种试剂的试剂盒。根据一 个实施方案，提供了试剂盒，其包括多种在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物 的抗体的珠粒、特异性地结合免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体，和使用多种珠 粒和可检测地标记的抗体测定来自供体的细胞样本和来自受体的生物样本以测定供体特 异性抗体在生物样本中的存在或不存在的说明书。主题试剂盒还可包括其它有用的组分， 诸如裂解缓冲液、对照血清或血浆、对照细胞样本等。在其表面上包含特异性结合免疫抗 体-Ag复合物的珠粒和特异性结合免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体可以是如上 文中针对本公开内容的方法所描述的。
[0090] 可在单独的管中提供包含在主题试剂盒中的试剂，或者可在单个管中提供两种或 更多种试剂。根据一个实施方案，在单独的管中提供珠粒和可检测地标记的抗体。在某些 方面，在裂解缓冲液中提供可检测地标记的抗体。
[0091] 根据一个实施方案，在计算机可读介质上提供包含在主题试剂盒中的指令，所述 指令，当由处理器执行时，使处理器按程序测定来自供体的细胞样本和来自受体的生物样 本以测定DSA在生物样本中的存在或不存在。
[0092] 兹里
[0093] 主题方法、系统和试剂盒用于其中期望检测受体的生物样本中的供体特异性抗体 的任何应用。目标受体包括，但不限于，有此需要的或已接受来自器官或组织供体的器官 (例如，肾、肝、心脏等）或组织植物物的人受体。目标应用包括基于检测和/或定量受体的 生物样本中的DSA的水平的移植后风险评估和/或稀释后监测。
[0094] 本公开内容的方法区分与供体细胞反应的抗体和与供体细胞上的HLA分子反应 的抗体。先前的流式交叉配型技术是有缺陷的，因为它们不能进行该重要的区分，其中阳性 流式交叉配型结果可能与抗体与HLA的相互作用完全无关。
[0095] 主题方法提供可被广泛用于开发许多不同的DSA测定的平台。来自受体的任何类 型的生物样本和任何目标靶细胞可用于确定DSA存在还是不存在。与现有方法相比较，所 述主题方法允许受体抗体以它们的无任何修饰的天然构型和以高检测特异度和高通量结 合供体抗原。此外，所述方法可在比现有DSA检测法更少的时间内完成，并且需要更少的供 体细胞。由与目标靶抗原无关的抗体引起的本底信号通过包括结合于目标抗原的DSA的复 合物的特异性抗体介导的固相捕获来消除。 实施例
[0096] 如可从上文提供的公开内容理解的，本公开内容具有广泛的应用。因此，提出下列 实施例以为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的完整公开内容和描述，所述 实施例无意限定被当作本发明的内容的范围，也不旨在表示下文的实验是所执行的全部 或唯一实验。然而，本领域普通技术人员将容易认识到可被改变或修改以产生基本上相似 的结果的多个非关键参数。已经做出努力以确保关于数字（例如量、温度等）的正确性，但 是应该占有一些错误和偏差。
[0097] 实施例1 =DSA-FM测试法
[0098] 下列方法可用于实施主题方法的一个实施方案（称为供体特异性抗体流式细胞 交叉配型（"DSA-FXM")）。本示例性方法包括同时捕获和标记，并且可以2小时或更短时 间内完成。
[0099] 首先，制备排列待测试的FXM样本的96孔布局格式。第二，按照板布局将 0. 2xl06(在体积上少于250 μ 1)供体细胞分配在96孔板中的所有预先选定的孔中。以 2, OOOxg离心3分钟。轻叩板并在翻转板之前在叠纸塔上印迹2次。通过轻轻涡旋重悬浮 细胞。按照板布局向预先选定的孔中添加50 μ 1/孔的每一种血清。轻轻涡旋板并在室温培 养箱（22°C)中孵育20分钟。在孵育过程中制备裂解缓冲液（对于每一个孔，PE-抗-hlgG 和裂解缓冲液于23 μ 1的总体积中）。孵育后，向每一个孔中添加250 μ 1的3% HBSA，并如 先前一样旋转板。轻叩板并在翻转板之前在叠纸塔上印迹2次。重复洗涤步骤另外2次， 每一次洗涤通过添加250 μ 1的3% HBSA来进行。
[0100] 在最后一次洗涤（第3次洗涤）时向每一个孔添加5 μ 1捕获珠粒混合物，如先前 一样使用250 μ 1的3% HBSA再次洗涤。向每一个孔添加23 μ 1裂解混合物（细胞裂解缓 冲液和荧光抗体）并轻轻涡旋板。用一张箱覆盖板，通过轻轻振荡在黑暗中孵育板30分钟。 如下在孵育过程中制备DSA-FXM洗涤缓冲液：制备IOml DSA-FXM洗涤缓冲液，向9. 5ml IX TBS洗涤缓冲液添加0. 5ml去垢剂，通过将管颠倒5次进行混合。
[0101] 通过向每一个孔添加250 μ I DSA-FXM洗涤缓冲液洗涤2次，如先前一样进行洗 涤。添加250 μ I DSA-FXM洗涤缓冲液并如先前一样洗涤。将珠粒重悬浮于每一个具有 200 μ1流动固定液的孔中，轻轻涡旋板。将板置于流式细胞柿饼上，并获取珠粒。实验结果 示于图3、图5-9、图11-14和图16中。
[0102] 对于图3中显示的实验，通过DSA-FXM(同时捕获和标记实施方案）测试4个样 本，并且HLA-I类与II类珠粒的区别在于每一个珠粒上的荧光ID。因 HLA特异性抗体而产 生的递增荧光（阳性信号）示于X轴（FL1通道）上。图3,图A :HLA-I类（C-I)和II类 (C-II)供体特异性抗体（DSA)都呈阴性CI-/CII-);图3,图B :仅C-II DSA呈阳性（Cl-/ CII+);图3,图C:仅C-I DSA呈阳性（CI+/CII-);和图3,图D:CI和C-II DSA都呈阳性 (CI+/CII+)〇
[0103] 如图5中所示，通过FXM、DSA-FXM和LMX-IgG针对不同的细胞数目测试不同稀释 度的HLA-Ab阳性血清（PPS)的汇集物。结果显示DSA-FXM是用于检测DSA的最灵敏的方 法，并且当与标准方法比较时，使用少得多的细胞（例如可用少至25, 000个细胞检测DSA)。 LMX-IgG使用单抗原珠粒在Luminex平台上确定了 PPS血清中包含的HLA特异性，并且显示 的值是平均荧光强度（MFI)。<