一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种生产α-酮基丁酸的基因工程菌及其构建方法和应用，利用该菌株发酵生产α-酮基丁酸具有较高的生产效率，属于生物【技术领域】。所述基因工程菌是对大肠杆菌Escherichia?coli?MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL。使用该菌采用发酵法生产α-酮基丁酸能够克服化学合成法、酶法或微生物转化法存在的反应条件复杂、能耗大、污染重或生产成本高污染大等不足，在发酵20-24h后，α-酮基丁酸产量达到8.5-15.7g/L，该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接发酵法生产α-酮基丁酸的报道。
【专利说明】—株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种生产α-酮基丁酸的基因工程菌及其构建方法和应用，利用该菌株发酵生产α -酮基丁酸具有较高的生产效率，属于生物【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]α -酮基丁酸(a-ketobutyric acid),又称 2_ 氧代丁酸(2_0xobutyric acid)、
2-酮基丁酸(2-Ketobutyric acid)等,是合成多种重要化学物质的中间体,被广泛用于医药、食品、化学等领域。如α -酮基丁酸可用于合成L-异亮氨酸、食品香料、1-丙醇、呋喃酮、保洛霉素、L- α -氨基丁酸以及D- α -羟基丁酸等物质。其中L- α -氨基丁酸是合成左乙拉西坦等抗癫痫药物的前体物，D-α -羟基丁酸是用来制备azinothricin家族抗癌药物。
[0003]目前α-酮基丁酸的生产方法包括化学合成法和生物合成法。前者可由丙酸乙酯和草酸二乙酯水解获得α-酮基丁酸。而迄今报道的生物法合成α-酮基丁酸主要包括酶法和微生物转化法。Nakahara等(1994)以1，2_ 丁二醇为碳源和底物，采用马红球菌(Rhodococcus equi) IF03730将其转化为α -酮基丁酸，培养32h转化率为68.2%。随后研究发现恶臭假单胞菌(Pseudomonas sputita)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM分别能将巴豆酸和DL-2-羟基丁酸转化为α-酮基丁酸，其产量为4.8g/L。祖尔布里根(2005，CN159278)采用一株粗糙脉胞菌的Ilv_3突变体以L-苏氨酸为底物发酵生产α -酮基丁酸，在优化条件下产量达8g/L。马翠卿等(2011)报道了以L-苏氨酸为底物利用含L-苏氨酸脱水酶的施氏假单胞菌SDM细胞为生物催化剂制备α -酮基丁酸的方法，反应20h转化率为49.9%。
[0004]尽管目前工业生产α -酮基丁酸主要采用化学合成法，但该方法存在反应条件复杂、能耗大、污染重等不足。而酶法`或微生物转化法存在着底物生产成本高污染大、难以实现大规模生产等不足。若能采用微生物发酵直接生产α-酮基丁酸，则可以解决上述问题和不足。
[0005]L-苏氨酸是合成α -酮基丁酸的前体物质，因此获得能够积累L-苏氨酸的菌株是发酵法生产α-酮基丁酸的必要前提。本发明中通过敲除苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL,以解除ThrL对L-苏氨酸合成途径中的关键酶编码基因(thrA、thrB、thrC)转录的弱化作用，达到增加L-苏氨酸合成的目的。
[0006]α -酮基丁酸可被乙酰羟基酸合成酶进一步代谢生成2-乙酰基-2-羟基丁酸，而大肠杆菌中共含3个乙酰羟基酸合成酶，分别为乙酰羟基酸合成酶I (由ilvBN基因编码)、乙酰羟基酸合成酶II (由ilvGM基因编码)以及乙酰羟基酸合成酶IIK由ilvIH基因编码)。本专利中所用出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655的乙酰羟基酸合成酶II大亚基编码基因ilvG因移码突变而不表达，故只需敲除乙酰羟基酸合成酶I和乙酰羟基酸合成酶III编码基因即可阻止α-酮基丁酸的进一步代谢。
[0007]综上所述，本专利通过增强α -酮基丁酸合成代谢流并阻断其进一步代谢途径实现发酵法生产α -酮基丁酸，不但能够达到减轻污染、降低成本的目的，还能缓解L-苏氨酸产能过剩的压力。然而，目前该方法还未见报道。
【发明内容】
:
[0008]本发明要解决的问题是克服化学合成法、酶法或微生物转化法存在的反应条件复杂、能耗大、污染重或生产成本高污染大等不足，提供一种产α -酮基丁酸的基因工程菌及采用该菌发酵生产α-酮基丁酸的方法。
[0009]本发明解决上述技术问题采用的技术方案之一是:提供一种生产α-酮基丁酸的大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌是在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655 (ATCC47076)中过表达来自该菌的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶I大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶III大亚基编码基因ilvl及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL所获得的突变株。
[0010]所述编码基因ilvA的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:1 ;
[0011]所述编码基因ilvB的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:2 ；
[0012]所述编码基因ilvl的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:3 ；
[0013]所述编码基因thrL的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:4 ；
[0014]本发明解决上述技术问题的技术方案之二是:提供一种构建上述基因工程菌的方法，包括如下步骤:
[0015](一)ilvB基因的敲除
[0016]1、采用PCR技术以大肠杆菌MG1655为模板，根据MG1655中ilvB(GeneID:948181)基因5’和3’端400bp序列设计同源臂引物，扩增获取ilvB基因的上下游同源臂。
[0017]2、采用PCR技术以pKD3质粒为模板，设计引物，扩增氯霉素抗性基因盒片段。
[0018]3、以1、2获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ilvB基因敲除片段，所述基因敲除片段由乙酰羟基酸合成酶I大亚基编码基因ilvB的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因盒片段组成。
[0019]4、将上述基因敲除片段导入含pKD46质粒的大肠杆菌MG1655感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB基因敲除菌。
[0020](二)ilvl基因的敲除
[0021]1、以步骤(一)中1-3相同的的方法构建ilvI(GeneID:947267)基因敲除片段。
[0022]2、将(二)_1中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB基因敲除菌感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilvl基因敲除菌。
[0023](三)thrL基因的敲除
[0024]1、以步骤(一)中1-3相同的的方法构建thrL (GeneID:948283)基敲除片段。
[0025]2、将(三)_1中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB、ilvl基因敲除菌感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilv1、thrL基因敲除菌THRZ。
[0026](四)ilvA基 因的过表达
[0027]1、将ilvA基因及其表达载体pWSK29用Xba I和BamH I进行双酶切后连接，连接产物转化至上述THRZ基因敲除菌中，通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌。
[0028]本发明解决上述问题所采用的技术方案之三是:提供一种发酵生产α -酮基丁酸的方法，包括以下步骤:
[0029]①种子培养:将本发明所述的大肠杆菌基因工程菌经活化后接种至装有IL种子培养基的5L发酵罐，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30_50%，通风量 3-5m3/h，搅拌转速 200-600rpm，32-37 °C 培养 6_8h。
[0030]②发酵罐发酵:以5%_10%接种量将步骤①的种子培养物接至装有6L发酵培养基的IOL发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37 °C，通风量3-5m3/h，搅拌转速300_1000rpm，溶氧维持在30-60%，流加浓度为60-80% (W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5%(ff/V)，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期20_24h。
[0031]③发酵液中α-酮基丁酸的检测:发酵液经SOOOXg离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后,采用UltiMate3000(Thermo Scientific)高效液相色谱仪测定α -酮基丁酸的含量。检测条件为:色谱柱REzex RoA-organic Acid H+,流动相5mmol/L H2SO4,流速0.5mL/min,柱温30°C，检测波长215nm，进样量为20 μ L。
[0032]所述种子培养基成分为:蔗糖15_25g/L，玉米浆15_25mL/L，酵母粉l_4g/L, (NH4)2SO4卜4g/L，KH2PO40.5-1.5g/L, MgSO40.1-0.5g/L, FeSO4.7Η200.01-0.05g/L,MnSO4.H2O0.010.05g/L, ρΗ7.0,0.075MPa 高压蒸汽灭菌 15min。
[0033]所述发酵培养基成分为:葡萄糖15_45g/L，酵母粉l_2g/L，豆饼水解液5_15mL/L，玉米浆 5-15mL/L, KH2P04l_5g/L，柠檬酸 0.5_2g/L，MgSO40.5-lg/L, FeSO4.7Η200.1-0.5g/L, MnSO4.H2O0.1-0.5g/L, ρΗ7.0,0.075MPa 高压蒸汽灭菌 15min。
[0034]有益效果:
[0035](I)本发明以Ε.coli MG1655 (ATCC47076)为出发菌株，利用代谢工程手段，通过强化并延伸L-苏氨酸合成α -酮基丁酸的途径以及切断后者进一步代谢的途径构建了生产α -酮基丁酸的大肠杆菌基因工程菌。在发酵20_24h后α -酮基丁酸产量达到8.5-15.7g/L。该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接发酵法生产α-酮基丁酸的报道。
[0036](2)该方法采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。
【专利附图】
【附图说明】:
[0037]图1ilvB敲除株构建示意图；
[0038]图2ilvB基因敲除PCR鉴定图谱；
[0039]其中M为Marker ；1为ilvB基因上游400bp片段；2为ilvB基因下游400bp片段；3 为 ilvBK ；
[0040]4为以E.coli MG1655基因组为模板、CHl和CH2为引物扩增的片段；
[0041]5为ilvBK整合到E.coli MG1655基因组后，以CHl和CH2为引物扩增的片段;
[0042]6为以ilvB基因敲除株基因组为模板、IDl和ID2为引物扩增的片段；
[0043]7为以E.c oli MG1655基因组为模板、IDl和ID2为引物扩增的片段；
[0044]图3ilvl敲除株构建示意图；[0045]图4ilvl基因敲除PCR鉴定图谱；
[0046]其中M为Marker; 1为ilvl基因上游400bp片段；2为ilvl基因下游400bp片段；3 为 ilvIK ；
[0047]4为以E.coli MG1655ilvB基因敲除株基因组为模板、CHl和CH2为引物扩增的片段；
[0048]5为ilvIK整合到E.coli MG1655ilvB基因敲除株基因组后，以CHl和CH2为引物扩增的片段；
[0049]6为以ilvB、ilvl双基因敲除株基因组为模板、ID3和ID4为引物扩增的片段；
[0050]7为以E.coli MG1655ilvB基因敲除株和为模板、ID3和ID4为引物扩增的片段；
[0051]图5thrL敲除株构建示意图；
[0052]图6thrL基因敲除PCR鉴定图谱；
[0053]其中M为Marker; I为thrL基因上游400bp片段；2为thrL基因下游400bp片段；3 为 thrL K
[0054]4为以E.coli MG1655ilvB基因敲除株基因组为模板、CHl和CH2为引物扩增的片段；
[0055]5为thrLK整合到E.coli MG1655ilvB基因敲除株基因组后，以CH5和CH6为引物扩增的片段；
[0056]6为以THRZ基因组为模板、ID5和ID6为引物扩增的片段；
[0057]7为以E.coli MG1655ilvB基因敲除株和为模板、ID5和ID6为引物扩增的片段；
[0058]图7重组质粒pW-1lvA及工程菌株KBA构建示意图；
[0059]图8重组质粒pW-1IvA的酶切电泳图谱；
[0060]其中M-Marker1-pW_iIvA 经 Xba I 和 BamH I 酶切；
[0061]图9基因工程菌KBA稳定性测试图。
实施例:
[0062]实施例1:E.coli MG1655酰羟基酸合成酶I大亚基编码基因ilvB的敲除
[0063]根据NCBI数据库中大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655中ilvB(GeneID:948181)基因5，和3，端400bp序列设计上、下游同源臂扩增引物ilvBl-F、i IvB1-R、i IvB3-F及i IvB3-R，并以该菌基因组DNA为模板扩增同源臂片段。
[0064]PCR条件为 94°C 5minl 个循环，94°C 30s、55°C 30s,72°C 40s30 个循环，72°C IOminl个循环，反应体系为100 μ Lo
[0065]将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将获得的片段分别命名为ilvBl、ilvB30
[0066]根据质粒pKD3中氯霉素抗性基因盒序列设计扩增引物ilvB2-F、ilvB2-R，并以该质粒为模板扩增氯霉素抗性基因盒片段。
[0067]PCR条件为 94°C 5minl 个循环，94°C 30s、55°C 30s,72°C 70s30 个循环，72°C IOminl个循环，反应体系为100 μ Lo
[0068]将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将获得的片段命名为ilvB2。
[0069]以ilvBl和ilvB2片段为模板，利用引物iIvBl-F和ilvB2R进行重叠PCR。[0070]PCR 条件为 94 °C 5minl 个循环，94 V 30s,55 V 30s,72 V 100s30 个循环，720C IOminl个循环，反应体系为100 μ L。
[0071]将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，命名为ilvBl-2。以ilvBl_2和ilvB3片段为模板，利用引物iIvBl-F和ilvB3_R进行重叠PCR，PCR条件为94°C 5minl个循环，94°C 30s、55°C 30s、72°C 120s30 个循环，72°C IOminl 个循环，反应体系为 100 μ L。将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得ilvB敲除片段，命名为ilvBK。
[0072]将ilvBK电转化至含pKD46质粒的E.coli MG1655感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于ImL SOC培养基中37°C、150rpm复苏Ih后涂布于含氯霉素(25 μ g/mL) LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物CHl和CH2通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，氯霉素抗性基因盒成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1054bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除氯霉素抗性基因，经42 V过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含氯霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物IDl和ID2进行验证，ilvB被成功敲除的菌株扩增片段约234bp，构建过程如图1所示，图2为PCR验证。
[0073]引物序列见表1。
[0074]其中:LB固体培养基(g/L):胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCllO，琼脂粉15，用蒸懼水定容至1000mL, 121 °C高压蒸汽灭菌20min。
[0075]SOC 培养基(g/L):胰化蛋白胨 20，酵母提取物 5，NaCl0.5，KC10.2，MgCl20.95，葡萄糖3.6。
[0076]实施例2:E.coli MG1655ilvB敲除株乙酰羟基酸合成酶III大亚基编码基因ilvl的敲除
[0077]根据NCBI 数据库中大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655ilvI (GeneID:947267)基因5’和3’端400bp序列设计同源臂扩增引物ilvIl-F、ilvIl-R、ilvI3_F及ilvI3_R，并以该菌基因组DNA为模板扩增同源臂片段。
[0078]PCR条件为 94°C 5minl 个循环，94°C 30s、55°C 30s,72°C 40s30 个循环，72°C IOminl个循环，反应体系为100 μ Lo
[0079]根据质粒pKD3中氯霉素抗性基因盒序列设计扩增引物ilvI2_F、ilvI2_R,并以该质粒为模板扩增氯霉素抗性基因盒片段，PCR条件为94°C 5minl个循环，94°C 30s、55°C 30s,72°C 70s30个循环，72°C IOminl个循环，反应体系为100 μ L。将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将获得的片段分别命名为ilvll、ilvl3和ilvI2。
[0080]以ilvll和ilvI2片段为模板，利用引物ilvIl-F和ilvI2R进行重叠PCR，PCR条件为 94°C 5minl 个循环，94°C 30s,55°C 30s,72°C 100s30 个循环，72°C IOminl 个循环，反应体系为100 μ L。将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，命名为ilvIl-2。以ilvl 1-2和ilvI3片段为模板，利 用引物ilvl1-F和ilvI3_R进行重叠PCR，PCR条件为940C 5minl 个循环，94°C 30s,55°C 30s,72°C 120s30 个循环，72°C IOminl 个循环，反应体系为100 μ L。将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得ilvl敲除片段，命名为ilvIK。
[0081]将ilvIK电转化至含pKD46质粒的E.coli MG1655ilvB基因敲除株感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于ImL SOC培养基中37°C、150rpm复苏Ih后涂布于含氯霉素(25 μ g/mL) LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物CHl和CH2通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，氯霉素抗性基因盒成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1054bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除氯霉素抗性基因，经42°C过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含氯霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物ID3和ID4进行验证，ilvl被成功敲除的菌株扩增片段约233bp。
[0082]构建过程如图3所示，图4为PCR验证。
[0083]引物序列见表1。
[0084]其中:LB固体培养基(g/L):蛋白胨10，酵母提取物5，NaCllO，琼脂粉15，用蒸馏水定容至1000mL, 121 °C高压蒸汽灭菌20min。
[0085]实施例3THRZ菌株的构建
[0086]据NCBI 数据库中大肠杆菌 E.coli MG1655 中 thrL(GeneID:948283)基因 5’和 3’端400bp序列设计同源臂扩增引物thrLl-F、thrLl-R、thrL3_F及thrL3_R,并以该菌基因组DNA为模板扩增同源臂片段。
[0087]PCR条件为 94°C 5minl 个循环，94°C 30s、55°C 30s,72°C 40s30 个循环，72°C IOminl个循环，反应体系为100 μ Lo
[0088]将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将获得的片段分别命名为thrLl、thrL3。
[0089]根据质粒pKD3中氯霉素抗性基因盒序列设计扩增引物thrL2-F、thrL2_R,并以该质粒为模板扩增氯霉素抗性基因盒片段。
`[0090]PCR条件为 94°C 5minl 个循环，94°C 30s、55°C 30s,72°C 70s30 个循环，72°C IOminl个循环，反应体系为100 μ Lo
[0091]将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将获得的片段命名为thrL2。
[0092]以thrLl和thrL2片段为模板，利用引物thrL 1-F和thrL2R进行重叠PCR。
[0093]PCR 条件为 94 V 5minl 个循环，94 V 30s,55 V 30s,72 V 100s30 个循环，720C IOminl个循环，反应体系为100 μ L。
[0094]将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，命名为thrLl-2。以thrLl_2和thrL3片段为模板，利用引物thrLl-F和thrL3_R进行重叠PCR，PCR条件为94°C 5minl个循环，94°C 30s、55°C 30s、72°C 120s30 个循环，72°C IOminl 个循环，反应体系为 100 μ L。将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得thrL敲除片段，命名为thrLK。
[0095]将thrLK电转化至含pKD46质粒的实施例2获得的iIvB、ilvl基因敲除株感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于ImL SOC培养基中37°C、150rpm复苏Ih后涂布于含氯霉素(25 μ g/mL) LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物CHl和CH2通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，氯霉素抗性基因盒成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1054bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除氯霉素抗性基因，经42°C过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含氯霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物ID5和ID6进行验证，thrL被成功敲除的菌株扩增片段约246bp。
[0096]构建过程如图5所示，图6为PCR验证。将构建成功的基因工程菌株命名为THRZ。
[0097]实施例4:1IvA基因的过表达
[0098]根据NCBI数据库中大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655中ilvA基因(GeneID:948287)序列设计引物ILA-F和ILA-R，以该菌基因组DNA为模板扩增ilvA基因。
[0099]PCR 条件为 94 V 5minl 个循环，94 V 30s,55 V 30s,72 V 130s30 个循环，720C IOminl个循环，反应体系为100 μ L。
[0100]取10 μ L PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后得到1.5-1.6kb的条带，与基因实际大小一致(1573bp)。将剩余90 μ L扩增片段回收后采用Xba I和BamH I进行双酶切，经
1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并取适应体积的回收片段采用T4连接酶连接至经相同酶切的表达载体PWSK29，采用CaClJi将其转化至大肠杆菌DHlO β感受态细胞中。挑取能在含氨苄霉素(100 μ g/mL)的LB固体培养上生长的菌落并利用引物P29F和P29R进行菌落PCR鉴定。提取经鉴定为阳性的转化子质粒委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果与预期一致，表明质粒构建成功，将其命名为pW-1lvA。构建过程如图7，验证如图8。
[0101]采用CaCl2法将重组质粒pW-1lvA转化至实施例3获得的ilvB、ilvl、thrL基因敲除菌。待含氨苄霉素(lOOyg/mL)的LB固体培养上生长出菌落后采用引物P29F和P29R进行菌落PCR鉴定，将经鉴定为阳性的转化子即为本发明所述基因工程菌，命名为KBA。
[0102]引物序列见表1。
[0103]表1用于PCR扩增敲除片段及过表达基因的引物序列
[0104]
【权利要求】
1.一种基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，并敲除乙酰羟基酸合成酶I大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶III大亚基编码基因ilvl及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于:所述苏氨酸脱水酶编码基因ilvA来自大肠杆菌E.coli MG1655，GeneID:948287，核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:10
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于:所述乙酰羟基酸合成酶I大亚基编码基因ilvB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2，所述乙酰羟基酸合成酶III大亚基编码基因ilvl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3，所述苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4。
4.一种构建权利要求1所述的基因工程菌的方法，包括如下步骤: (一)ilvB基因的敲除 Cl)采用PCR技术以大肠杆菌MG1655基因组为模板，根据MG1655中ilvB(GeneID:948181)基因5’和3’端400bp序列设计同源臂引物，扩增获取ilvB基因的上下游同源臂； (2)采用PCR技术以pKD3质粒为模板，设计引物，扩增氯霉素抗性基因盒片段； (3)以步骤(1)、(2)获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ilvB基因敲除片段，所述基因敲除片段由乙酰羟基酸合成酶I大亚基编码基因ilvB的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因盒片段组成； (4)将上述基因敲除片段导入含有 PKD46质粒的出发菌株感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB基因敲除菌； (二)ilvl基因的敲除 (1)以步骤(一)中(1)-(3)相同的的方法构建ilvI(GeneID:947267)基因敲除片段，所述ilvl基因敲除片段由ilvl的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因盒片段组成； (2)将(二)_(I)中的基因敲除片段导入含有PKD46质粒的ilvB基因敲除菌感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilvl基因敲除菌； (三)thrL基因的敲除 (1)以步骤(一)中1-3相同的的方法构建thrL(GeneID:948283)基敲除片段； (2)将(三)-(1)中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB、ilvl基因敲除菌感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilv1、thrL基因敲除菌； (四)ilvA基因的过表达 将ilvA基因及其表达载体PWSK29用Xba I和BamH I进行双酶切后连接，连接产物转化至上述ilvB、ilv1、thrL基因敲除菌，通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌。
5.权利要求1所述一种基因工程菌，其特征在于，出发菌株来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomounas)或芽抱杆菌属(Bacillus)。
6.权利要求1所述的基因工程菌在发酵法生产α-酮基丁酸中的应用。
7.利用权利要求1所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，步骤如下: (1)种子培养:将本发明所述的基因工程菌活化后，接种至装有IL种子培养基的5L发酵罐，流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30_50%，通风量3_5m3/h，搅拌转速 200-600rpm，32-37 °C 培养 6_8h。 (2)发酵罐发酵:以5%-10%接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6L发酵培养基的IOL发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37°C，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-60%，流加浓度为60-80%W/V的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5%W/V，流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期20_24h。
8.根据权利要求6所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，其特征在于:发酵液中α -酮基丁酸的检测方法如下:发酵液经8000 Xg离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，采用高效液相色谱仪测定α-酮基丁酸的含量，检测条件为:色谱柱REzexRoA-organic Acid H+,流动相 5mmol/L H2SO4,流速 0.5mL/min,柱温 30°C,检测波长 215nm,进样量为20 μ L。
9.根据权利要求6所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，其特征在于: 所述种子培养基成分为:蔗糖15-25g/L，玉米浆15-25mL/L，酵母粉l_4g/L, (NH4) 2S04l-4, KH2PO40.5-1.5g/L, MgSO40.1-0.5g/L, FeSO4.7Η200.01-0.05g/L,MnSO4.H2O0.010.05g/L, pH7.0,0.075MPa 高压蒸汽灭菌 15min ； 所述发酵培养基成分为:葡萄糖15_45g/L，酵母粉l_2g/L，豆饼水解液5-15mL/L，玉米浆 5-15mL/L, KH2P04l_5g/L，柠檬酸 0.5_2g/L，MgSO40.5-lg/L，FeSO4.7Η200.1-0.5g/L,MnSO4.H2O0.1-0.5g/L, ρΗ7.0,0.075MPa 高压蒸汽灭菌 15min。
【文档编号】C12P7/40GK103865869SQ201410132996
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】陈宁, 张成林, 谢希贤, 徐庆阳, 刘淑云, 刘远, 刘宏亮 申请人:天津科技大学