一株产l-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用的制作方法
【专利摘要】一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法及应用，属于基因工程和微生物发酵【技术领域】。本发明构建了基因 alr 的敲除载体，电转到宿主菌中，得到 alr 的缺陷菌株IWJ001Δ alr 。利用PCR扩增基因 fusA ， frr ， ilvBN ， ilvA ， ppnk ，将基因片段连接到过表达载体，然后电转入谷氨酸棒杆菌IWJ001Δ alr 中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌：产L-异亮氨酸基因工程菌IWJ001Δ alr /pJYW-4- fusA - frr - ilvBN-ilvA - ppnk 。本发明构建的产L-异亮氨酸基因工程菌在摇瓶发酵或发酵罐发酵均可提高L-异亮氨酸的产量，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低L-异亮氨酸生产成本。CCTCC NO：M201452920141029
【专利说明】一株产L-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法，及其提高氨基酸产量 的应用，属于基因工程和微生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002] L-异亮氨酸，又称L-异白氨酸，化学名为L-α-氨基-β-甲基戊酸，属于天冬氨 酸族非极性、输水性氨基酸的一种。由于在α位和β位具有两个手性碳原子，所以有4种 立体异构物，分别为D、L、D别、L别型，存在于自然界并具有生理功效的异亮氨酸只有L型。 L-异亮氨酸广泛存在于多种动植物蛋白质中，是常见十八种氨基酸的一种，也是人体八种 氨基酸之一，另外由于它与L-亮氨酸、L-缬氨酸的分子结构中都含有一个甲基侧链而被称 为支链氨基酸。
[0003] L-异亮氨酸作为人体必需的8种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有 促进蛋白质合成和抑制分解的效果，但体内无法自身合成，成年人每天需要从外界摄取20 mg/kg (体重）的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有 广泛的应用及商业价值。
[0004] 在食品行业中，L-异亮氨酸可强化某些食品的营养，如小麦粉、麦谷蛋白、花生粉、 马铃薯等所含L-异亮氨酸为限制性氨基酸，待强化。L-异亮氨酸与其他氨基酸结合，可改 善面包、饼干、软糖、波纹面等食品的形态、性状、色泽、味道、营养。L-异亮氨酸与其他氨基 酸配制成氨基酸能量饮料和运动员饮料，有形成肌肉、减轻肌肉疲劳，提高运动员的耐性， 促进骨骼肌蛋白的合成速率及减少蛋白的降解速率，利于肌肉恢复。另外，L-异亮氨酸还 可制作成生酮饮食治疗癫痫病。
[0005] 在医药行业中，主要用于配制复方氨基酸输液，包括营养型氨基酸输液、治疗型高 支链氨基酸输液及各种口服液制剂，为肝硬化患者提供蛋白和能量，促进冠动脉患者心肌 蛋白周转，提高尿毒症患者的食欲和营养，避免营养不良，为间质性肝炎提供蛋白和能源。
[0006] 在饲料行业中，L-异亮氨酸作为动物营养有着特殊的作用，因此受到研究者的广 泛关注。目前，L-异亮氨酸制成饲料添加剂，节省蛋白质饲料，使饲料成分得到利用，提高 饲料利用率，从而降低成本。在豆柏型基础日粮中添加 L-异亮氨酸，可提高牛的肌肉生长。 在猪饲料中添加 L-异亮氨酸可提高肥猪对甲硫氨酸的利用。当L-异亮氨酸与其他氨基酸 和蛋白一同饲喂奶牛，可提高牛奶中的蛋白含量。在泌乳型母猪的饲料中添加 L-异亮氨 酸，可改善母猪的采食量和泌乳代谢。在发情期的母羊饲料中添加 L-异亮氨酸可提高母羊 的排卵率。
[0007] 在卫生保健行业中，L-异亮氨酸可提高人体的免疫力，促进人体能量的消耗，减少 脂肪量，可用于减肥药的配制。通过糖皮质激素来控制血糖，减少中枢性疲劳。另外，L-异 亮氨酸对治疗运动型障碍及外伤有一定作用，可减少迟发性运动障碍的症状，治疗伤口，改 善受伤导致的认知障碍。
[0008] 由于L-异亮氨酸的可用领域广泛，并且新的用途被不断发现，大大增加了市场需 求量。目前，国内已有厂家进行批量生产L-异亮氨酸，但是这些企业生产的菌株产酸能力 低，生产工艺和生产设备落后于日本等国，产量不能满足市场需求。因此，改善菌株生产能 力、优化工艺流程、配备先进设备成为我国丞待解决的问题。
[0009] 在本发明中，我们以L-异亮氨酸生产菌IWJ001为基础，构建了 Wr基因缺陷宿主 菌，并在表达载体pJYW-4上表达了基因簇左，由于该表达载体上 带有基因，弥补了宿主菌的夬失，因此无需添加抗生素即可保证表达载体在菌体内 的稳定存在及组成表达。本发明构建的工程菌提高了 L-异亮氨酸产量。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法及应用，本发 明构建的工程菌提高了 L-异亮氨酸产量。
[0011] 本发明的技术方案：一株产L-异亮氨酸基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum) IffJOOl Δ alr/x>Jf^-\-fusA-fri^ilvBN-ilvk-ppnk, B 1? 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO :M2014529。
[0012] 通过质粒回补基因组a/r基因缺陷，从而使表达载体在无抗生素添加情况下稳定 存在于菌体中并行使表达功能，所述菌株包括a/r基因缺陷型表达宿主。
[0013] 所述表达宿主是被敲除了编码丙氨酸消旋酶的基因 a/r的谷氨酸棒状杆菌 i Corynebacterium glutamicum)。
[0014] 所述表达宿主是将ah#除载体转化入谷氨酸棒杆菌，通过同源重组获得的 缺陷型表达宿主，所述<37^除载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 本发明所解决的第一个技术问题是，夬陷型表达宿主，其构建方法，主要步骤 为： (1)以 C IWJ0001 基因组为模板，分别以 Wi-S- (+)八-）及 Wi-X- (+) / (_)为引物扩增各IOOObp的Wr基因上下游片段ah-U、ah-D ;以pDTW-202 (Jinyu Hu, Yanzhen Tan, Yanyan Li, Xiaoqing Hu, Daqing Xu, Xiaoyuan Wang, 2013. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Wwiaffiicaa )为模板，^a/T-lox-F/R 为引物扩增 抗性基因片段。 以通〇1、及丽?酶切，以油al及AiI酶切，h/7片段以及丽?、油al酶切，三片 段一起连入以通〇1及酶切的pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒即a/ri敲除载 体，命名为PJXW-I。
[0016] (2)将ah#除载体转化宿主菌，通过同源重组获得a/r基因缺陷型表达宿主菌。
[0017] 本发明要解决的第二个技术问题是在载体pJYW-4表达基因/rr， i 儿/7/7/4,主要步骤为： (1)扩增基因片段：在两端分别引入AbiI及AXeI酶切位点；将 PCR产物ΛΛ^-frr片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体pJYW-4,得 到重组表达质粒pJYW-4-/i/5^-/rr; (2 )扩增灰基因片段，在1^-/7/7/?纟两端分别引入5fil及 酶切位点；将PCR产物ihftV-i/以-/7/7/4片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切 的表达载体 pJYW-4-/i/5^-/rr，得到重组表达质粒 pJYW-4-/i/5^-/r_/^7riW-27F^-/7/7/7釦 (3)将重组表达质粒pJYW-4-/i/5^-/>tiJViW-iJVJ-/7/7/7纟转入通过a/rj敲除载体敲除 基因的谷氨酸棒状杆菌，得基因工程菌IWJOOl Λ pnk 〇
[0018] 表达基因成#-27以-/7/7/7左，其核苷酸序列分别为：Λ/5^为SEQ ID NO. 2, /rr 为 SEQ ID NO. 3, 以为 SEQ ID NO. 4, ihftV 为 SEQ ID NO. 5，/7/7/7* 为 SEQ ID NO. 6。
[0019] 所述产L-异亮氨酸基因工程菌的应用，发酵产L-异亮氨酸。
[0020] 本发明的有益效果：该菌株不依赖抗生素抗性即可维持表达载体稳定的存在于谷 氨酸棒状杆菌细胞内，利于工业化生产。且能较大幅度提高L-异亮氨酸产量。
[0021] 生物材料样品保藏：谷氨酸棒杆菌（a? WwiaffiicawHWJOOl Δ a/r/ pJYW-4-/i/5^-/ri-iTViW-i7VA-/7/7/7左，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉 大学，保藏日期2014年10月29日，保藏编号：CCTCC NO :M2014529。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图I Wr基因敲除载体pJXW-I的构建。
[0023] 图 2 表达载体 左的构建。
[0024] 图3菌株摇瓶发酵及氨基酸产量变化示意。
[0025] 图4菌株罐上发酵的菌体生长量变化图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例I WiT敲除载体pJXW-I的构建 以C IWJ001基因组为模板，分别以Wi-S- (+)八-）及Wi-X- (+)八-）为 引物扩增各 IOOObp 的 a/r基因上下游片段 a//HJ、aZr^D;以 pDTW_202(Jinyu Hu, Yanzhen Tan, Yanyan Li, Xiaoqing Hu, Daqing Xu, Xiaoyuan Wang, 2013. Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium Wwiaffiicaa )为模板，^a/T-lox-F/R为引物扩增抗性基因片段。a//HJ以ZSoUafflM 酶切，ah-D以油al及AiI酶切，Aa/?片段以油al酶切，三片段一起连入以沿〇1及 AiI酶切的pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒即<3勿敲除载体，命名为pJXW-1 (图 2)。
[0027] 实施例2表达载体的构建 首先，以质粒pDXW-8-/i/5^-/rr为模板，/i/5^-F，为引物，扩增基因片 段，在ZiM-Zrr两端分别引入AfoiI及船el酶切位点；将PCR产物ZiM-Zrr片段以相应限 制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的PJYW-4,完成表达质粒构建pJYW-4-/iA^-/rr。
[0028] 以质粒 pDXW-8_i7FiW-i7FA-/7/7/7々（Yin L，Zhao J，Chen C，Hu X，Wang X (2014) Enhancing the carbon flux and NADPH supply to increase L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum·')为後版,/7/7/7左一1?为弓丨物，扩 增以-p/7/7灰基因片段，在纟两端分别引入5fil及lei酶切位 点；将PCR产物片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的 pJYW-4-/i/5^-/>T，完成表达质粒构建 PJYW-4-//75^-/>t FiW-i/F^-p/7/7左。
[0029] 然后，将 转入 IWJOOl Δ a/r，构建基因工程菌 株 air /dYW-A-fusA-fri^ ilvBN-ilv k-ppnk。
[0030] 实施例3摇瓶发酵 从保藏菌株 IWJ001 Δ a/r/pJYW-4-/i/5^-/>ti/FiW-i/FA-/7/7/7左的甘油管中划取一环 菌液在固态活化培养基上划线，30°C培养36 h。利用接种环从活化好的平板上刮取一环菌 苔转接到装有25mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30°C，200 r/min培养18 h。从培养好 的种子液中吸取2. 4 mL菌液转接至装有23mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30°C培养6 h，加入终浓度为I mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导蛋白表达直至发酵结束（t=72h)。
【权利要求】
1. 一株产L-异亮氨酸基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Cb_r_F/76^acte_riw? IWJ001 A 左，已保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏编号：CCTCC NO :M2014529。
2. 根据权利要求1所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，通过质粒回补基因组 基因缺陷，从而使表达载体在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能， 所述菌株包括a/r基因缺陷型表达宿主。
3. 根据权利要求2所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，所述表达宿主是被敲 除了编码丙氨酸消旋酶的基因 a/r的谷氨酸棒状杆菌（Cb_r_F/?6^acte_riy?
4. 根据权利要求2或3所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，所述表达宿主是 将37^#除载体转化入谷氨酸棒状杆菌，通过同源重组获得的<^^夬陷型表达宿主，所述 <^痛除载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1。
5. 根据权利要求4所述产L-异亮氨酸基因工程菌，所述陷型表达宿主，其构建 方法，其特征在于，主要步骤为： (1) 以 C IWJ001 基因组为模板，分别以 Wi-S4+V(-)及 Wi-X_(+)/ (-)为引物扩增各l〇〇〇bp的Wr基因上下游片段ah-U及ah-D ;以pDTW-202为模板， h/^lox-F/R为引物扩增h/7抗性基因片段；ah-U以沿〇1、酶切，ah-D以 及酶切，h/?片段以油al酶切，三片段一起连入以沿〇1及酶切的 pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒即ah#除载体，命名为pJXW-1; (2) 将ah#除载体转化宿主菌，通过同源重组获得a/r基因缺陷型表达宿主菌。
6. 根据权利要求1或5所述产L-异亮氨酸基因工程菌，其特征在于，共表达了基因 其核苷酸序列分别为为 SEQ ID NO. 2, />?/?为 SEQ ID NO. 3, 以为 SEQ ID NO. 4, 成V 为 SEQ ID NO. 5，/7/7/7左为 SEQ ID NO. 6。
7. 根据权利要求1、5或6所述产L-异亮氨酸基因工程菌，所述表达载体pJYW-4- -/7/7/4,其构建方法，其特征在于，主要步骤为： (1)扩增/i/y-frr基因片段：在/i/y-frr两端分别引入Ab(I及AXel酶切位点；将 PCR产物/M-frr片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体pJYW-4,得 到重组表达质粒pJYW-4-/i/5^-/rr; (2 )扩增rA-/?/?/?灰基因片段：在以-/7/7/7^两端分别引入5fil及lei 酶切位点；将PCR产物片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切 的表达载体pJYW-4-/i/5^-/rr，得到重组表达质粒卩几1-4-/1/5^-/>7^71^#-27以-/?/?/成- (3) 将重组表达质粒卩几1-4-/1/5^-/>7-271^#-27以-/7/7/7纟转入通过3//?除载体敲除 基因的谷氨酸棒状杆菌，得基因工程菌IWJ001 A WpJYW-4-/i/y-/d7j^V-ihA-/7 pnk 〇
8. 权利要求1、5或6所述产L-异亮氨酸基因工程菌的应用，其特征在于用于发酵产 L-异亮氨酸。
【文档编号】C12N15/77GK104480057SQ201410726700
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】王小元, 赵建勋, 胡晓清, 胡瑾瑜 申请人:江南大学