具有高产10-dab特性的红豆杉细胞株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（ Taxuswallichianavar.mairei ） ，命名为：南方红豆杉植物细胞系N12#，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.10001。本发明更进一步公开了10-DAB（10-DeacetylbaccatinⅢ，CASNO:32981-86-5）高产细胞系的筛选和建立，本发明从红豆杉外植体中诱导筛选出一株高产10-DAB的细胞系，实验结果证明：该细胞系高产次生代谢产物10-DAB等紫杉烷类化合物，可用于紫杉醇和多西紫杉醇的原料药前体的生产。CGMCC No1000120141119
【专利说明】具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株及其应用 【技术领域】
[0001] 本发明属于植物细胞培养【技术领域】，具体涉及一种具有高产10-DAB特性的红豆 杉细胞株（/1SjTo1S Far. ?airei)及其应用。 【背景技术】
[0002] 10-去乙酰巴卡亭III (lCKdeacetyl baccatin III，简写为ICHMB )是从红豆杉短 枝叶中分离、提取得到的一种紫杉烷二萜类化合物，不但自身有抗癌活性，而且是生物合成 与化学半合成紫杉醇和多烯紫杉醇的重要前体化合物，在解决临床治疗和科学研究用紫杉 醇和多烯紫杉醇药源问题中起着不可替代的作用。国内外学者对红豆杉细胞悬浮培养生产 紫杉醇进行了大量的基础性研究工作，但离工业化生产还有很大的距离。有关红豆杉细胞 培养生产10-DAB的研究报道很少。本发明通过红豆杉细胞培养生产10-DAB，再经过化学半 合成生产紫杉醇和多烯紫杉醇，是一条在不破坏红豆杉野生植物资源基础上能实现资源再 生利用的有效途径。
[0003] 10-DAB 即 10-脱乙醜基巴卡丁 III (IO-Deacetylbaccatin III，CAS NO: 32981-86-5)，可以从红豆杉中提取，其最主要的作用是作为多烯紫杉醇的合成前体。多烯 紫杉醇同紫杉醇一样是抗癌药物，但由于紫杉醇的水溶性差，阻碍了活性的发挥，所以溶解 性更好的多烯紫杉醇成为了紫杉醇的替代品。相较于紫杉醇，多烯紫杉醇具有如下特点： 1、 水溶性更优，是紫杉醇的数十倍； 2、 活性更高，其活性是相同剂量的紫杉醇的数倍； 3、 所需治疗的总费用远远小于紫杉醇 但是目前多烯紫杉醇无法通过天然植物提取，只能通过生产10-DAB后利用化学物理 合成方法进行生产。因此开发10-DAB的大规模细胞培养生产具有良好的市场前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高产10-DAB的红豆杉细胞株。为了解决此问题，本发明 所采用的技术方案是 ： 一种具有高产IO-DAB特性的红豆杉细胞株rar. ?airei)，命 名为：南方红豆杉植物细胞系N12#，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏，保藏号 CGMCC No. 10001。
[0005] 本发明进一步公开了具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. ffiairei)，保藏号CGMCC No. 10001在用于制备多烯紫杉醇合成前体药物方面的应用。 特别是用于制备紫杉醇和多西紫杉醇原料药前体的生产方面的应用。
[0006] 本发明更进一步公开了具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. ffiairei)，保藏号CGMCC No. 10001的筛选方法，其特征在于按如下的步 骤进行： (1)外植体诱导愈伤细胞。
[0007] (2)愈伤组织稳定继代生长 (3)固体愈伤细胞小细胞团法选种和启动液体悬浮培养自然选种。
[0008] 本发明还公开了采用10-DAB特性的红豆杉细胞株，生产10-去乙酰巴卡亭III的方 法，其特征在于 ： (1)固体愈伤细胞自然生产。
[0009] (2)液体悬浮培养自然生产。
[0010] (3)液体悬浮培养组合调控的方法获得高产。
[0011] 具体是将14代悬浮细胞接种按照称重法接种鲜细胞至PN调控培养基，培养基用 IOOml三角瓶装量20ml，接种量6g/瓶，分两步法培养，周期28天，暗培养，100转/分，采用 25°C培养。在细胞培养的第4天添加甲基茉莉酸100 μ M，第10天添加硝酸银10 μ M，第28 天收获细胞和培养液。结果=IO-DAB产量达150mg/L，产物还有紫杉醇50mg/l和微量巴卡 亭III〖1L 本发明还公开了具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. 通过特异性扩增18S的部分ITS片段与南方红豆杉序列进行比对，序列一致，其特 征在于从基因角度证明该10-DAB高产细胞系属于南方红豆杉。
[0012] 本发明更加详细的技术内容如下： (1)本发明提供的具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株π 入命名为：南方红豆杉植物细胞系N12#，所述的细胞系是由北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，命名南方红豆杉植物细胞系N12#，保 藏日期2014年11月19日，保藏号CGMCC No. 10001，分类学名称，曾用名Timz1S ?airei， Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K，最氣分类学^iTaxus wallichiana var. mairei〇
[0013] (2) 10-DAB 特性的红豆杉细胞株Far. ?airei)的培养特征 及生理生化指标： 1)本细胞株生长缓慢稳定，生长量2倍/14天，不易染菌，适应生长温度25°C，暗培养， 生长最适PH值5. 8,糖浓度20g/L。
[0014] 2)本细胞株固体细胞偏干，棕色，培养基底部无分泌物； 3)本细胞株悬浮细胞，细胞颗粒饱满，大小均匀，像小米粒，上清培养液乳白色，浑浊。
[0015] (3) 10-DAB 特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei)的 18S DNA ITS基因序列见图10 18S DNA ITS序列的blast比较图。
[0016] (4)10_DAB特性的红豆杉细胞株raBicAiafla rar. ?airei)的筛选方法： 首先进行外植体诱导，将固体愈伤组织多次继代，直至生长稳定，采用自然选种和组合调控 两种方法进行选种。
[0017] 固体自然选种，选择5代生长稳定，细胞状态颜色均匀的细胞团作为选种的出发 细胞株，用小细胞团的方法来将一个2g左右的大细胞团通过称重法分成几个小的0. 5g的 小细胞团，培养一个周期后，取每个细胞团的一半检测一半继续继代培养。目的是通过小细 胞团，将不同特性的细胞分开，达到选种的目的。
[0018] 液体悬浮培养自然选种，选择5代生长稳定，细胞状态均已一致的的固体愈伤细 胞进行各种激素培养基的液体悬浮，采用称重法接种，多次继代培养，每次继代检测细胞培 养上清液和细胞样。目的是通过激素的变化刺激细胞株，达到选种的目的。
[0019] 液体悬浮培养组合调控方法选种，仍然采用液体悬浮的方法将细胞进行悬浮培养 放大，再去组合调控，通过添加前体、调控剂等，刺激细胞，达到选种目的。
[0020] 本发明公开的10-DAB特性的红豆杉细胞株rar. ?airei」所 具有的有益效果在于： (1)本文通过红豆杉细胞培养生产10-DAB，再经过化学半合成生产紫杉醇和多烯紫杉 醇，是一条在不破坏红豆杉野生植物资源基础上能实现资源再生利用的有效途径。
[0021] (2)产量高，成本低。本细胞株具有高产10-DAB的特性，产量高达120mg/L，据报 道,新鲜红豆杉外植体叶片中10-DAB含量3mg/g (干重)，本发明中IL的产量需要40g干重 的红豆杉叶片，即需要大约400g的新鲜叶片。本细胞株生成IL产物的成本远远小于种植 红豆杉的土地，人工等费用。解决了红豆杉资源的频繁砍伐和种植。
[0022] (3)提取分离纯化简单，收率高。本细胞株生成10-DAB，细胞培养结束后，下游提 取分离纯化简单，收率高达80%以上。再次保护了红豆杉自然资源，并且为合成紫杉醇和多 西紫杉醇提供了原料。
[0023] 【专利附图】
【附图说明】： 图1为样品检测图谱；愈伤细胞悬浮培养14天后，培养基上清液中的10-DAB的UPLC 检测图谱； 图2为样品+STD图谱；图1中W422样品加10-DAB标准品后的UPLC检测图谱。
[0024] 图3为外植体图；自然界生长的红豆杉的嫩茎； 图4为诱导成功愈伤细胞的外植体图；外植体嫩茎经过诱导后，含有愈伤细胞的外植 体状态； 图5为14代的愈伤细胞图；外植体诱导的愈伤组织细胞，经过14代稳定继代后的细 胞； 图6为15代悬浮细胞图；细胞在液体培养基生长15代的悬浮状态； 图7为400倍放大镜检细胞图片；悬浮细胞在显微镜下物镜40倍放大，目镜10倍观察 的细胞； 图8为纯化样品色谱图；经过调控的28天悬浮细胞和上清液，去除部分杂质后的 10-DAB 的 UPLC 图谱； 图9为纯化样品中10-DAB质谱图；其中保留时间为0. 545min色谱峰的545. 3 ([M+H]+) 及591. 3 ([M+2Na+H]+)可以判断该峰对应的化合物为10-DAB ; 图10 18S DNA ITS序列及blast比对图；其中特异性扩增片段都分布在南方红豆杉属 中，序列覆盖范围（Query coverage)均达到99%，最大相似性（Max identity)均在99% 以上。
[0025] 【具体实施方式】： 【具体实施方式】： 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人 员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明 的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。下面通过实例来进一步阐明10-DAB特 性的红豆杉细胞株的制备方法。本发明所用到的试剂除特别指出外均有市售。
[0026] 实施例I 产10-DAB高产细胞株保藏号CGMCC No. 10001的诱导 (1)由南方红豆杉外植体诱导细胞株的愈伤组织保藏号CGMCC No. 10001 将外植体进行清洗、75%酒精消毒、0. 1%氯化汞消毒，接种、培养。
[0027] 1、外植体消毒 1. 1清洗 将外植体放入清水盆中，加少量洗洁精，用手轻轻搓洗外植体表面，然后用干净的自来 水冲洗3遍,用纯化水冲洗3遍,最后用超纯水冲洗3遍。洗干净后放置在干净的滤纸上， 将叶片和嫩茎分开，叶片放在有干净滤纸的平皿内，吸取多余的水分，并盖上盖子。嫩茎用 剪刀剪成小段，同样放在有干净滤纸的平皿内盖好盖子等待消毒备用。
[0028] 1. 2 消毒 将洗干净的叶片和嫩茎，倒入烧杯内，先用75%酒精消毒30s，将酒精倒掉，用无菌水清 洗2遍，每遍l-2min。再用氯化萊溶液消毒15min，再用无菌水清洗3遍，每遍l-2min。消 毒完毕后，放入无菌平皿内，接种备用。
[0029] 2、接种 2. 1叶片的接种 用镊子夹取叶片，用剪刀将叶片中间剪若干小口。将剪好的叶片接种至诱导培养基内， 每个平皿内接种5-6个叶片。
[0030] 2. 2嫩茎的接种 将消毒好的嫩茎段，用镊子夹取，并用剪刀剪成适当长度的小段，接种至诱导培养基 内，每个平皿内接种5-6个茎段。
[0031] 3、 培养及诱导：将接种好叶片和茎段的平皿用封口膜包好，放置在25土rc培 养箱，暗培养，周期30天[2i。 (1)诱导结果诱导培养基及诱导率：将叶片和茎段接入B5优化、WPM、B5-PVP、WR、 B5-US五种培养基（详见诱导培养基见表1) 13】。
【权利要求】
1. 一种具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. ffiairei)，命 名为：南方红豆杉植物细胞系N12#，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏，保藏号 CGMCC No. 10001。
2. 权利要求1所述具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. aairei入保藏号CGMCC No. 10001在用于制备多烯紫杉醇合成前体药物方面的应用。
3. 权利要求2所述的应用，其中用于制备多烯紫杉醇合成前体药物指的是用于制备紫 杉醇和多西紫杉醇原料药前体的生产。
4. 权利要求1所述具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. 入保藏号CGMCC No. 10001的筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 外植体诱导愈伤细胞； (2) 愈伤组织稳定继代生长； (3) 固体愈伤细胞小细胞团法选种和启动液体悬浮培养自然选种。
5. -种采用10-DAB特性的红豆杉细胞株生产10-去乙酰巴卡亭III的方法，其特征在 于： (1) 固体愈伤细胞自然生产； (2) 液体悬浮培养自然生产； (3) 液体悬浮培养组合调控的方法获得高产。
6. 权利要求1所述具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. 18S的部分ITS片段，此18S的部分ITS片段与南方红豆杉序列进行比对，序列一 致，其特征在于从基因角度证明该10-DAB高产细胞系属于南方红豆杉。
【文档编号】C12R1/91GK104403987SQ201410726274
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】王丽, 朱瑞雪, 刘晓月, 王海燕, 张桂才, 张卫 申请人:天津艾赛博生物技术有限公司