联产丁醇与2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种联产下醇与2,3-下二醇的基因工程 菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 2,3-下二醇是一种无色、无嗅的液体，具有较强的吸湿性。常溫下为液体，黏度 30.6mPa . S，沸点为178~182°C，冰点为-60°C，与水互溶，溶于乙酸、乙醇，在聚合体合成中 用作单体。2,3-下二醇是一种重要的生物基四碳平台化合物，广泛用于食品、化工、航空航 天燃料等领域。
[0003] 2,3-下二醇生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类，化学合成法是利 用化石原料生产2，3-下二醇成本高，且条件苛刻、过程繁琐，容易对环境造成污染，而化石 原料日益枯竭，因此化学合成法工业化生产较困难;生物转化法是利用可再生资源生产2， 3-下二醇，生物法既克服了化学法生产的原料问题，又符合绿色化工的要求，因此受到了人 们越来越多的关注。目前2,3-下二醇高产菌株主要是1(1日631日11日、6]11日1'〇6日(31日1'和 Serratia属的菌株，然而运些菌株具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求。而目前 报道的安全菌株如B.subtilis合成2,3-下二醇的效率太低。
[0004] 丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)，是目前生产下醇的主要菌种。其 发酵产物除下醇外，还有丙酬和乙醇，因此在生产中又被称为ABEUcetone-Butanol-^hanol) 发酵。通常， 60g/L 的葡萄糖经丙酬下醇梭菌发酵可产生 12g/L 的下醇， 6g/L 的丙酬 W及2g/L的乙醇，下醇：丙酬：乙醇的比值为6:3:l(w/w)。在丙酬下醇梭菌中导入乙酷乳酸 脱簇反应酶和乙偶姻还原酶后，除A肥产物外，丙酬下醇梭菌还会产生不少量的2，3-下二 醇。更重要的是，2,3-下二醇生产过程中会有还原力(NADH或NADPH)的产生，在2,3-下二醇 的专性生产菌株中，运些还原力需被化氧化的方式实现NAD+的再生，从而造成还原力的浪 费。而丙酬下醇梭菌中下醇合成过程恰恰是一个缺乏NAD(P化的过程，W致下醇发酵中有大 量的氧化态副产物丙酬的生成。因此，在丙酬下醇梭菌中构建2,3-下二醇合成途径，能够利 用2,3-下二醇合成过程中产生的还原力补偿下醇合成过程所需的还原力，从而在NAD(P)H 代谢平衡的基础上W丙酬为代价生产2，3-下二醇。
[0005] 提高丙酬下醇梭菌的2,3-下二醇产量有W下几方面的意义：
[0006] (1)提高传统ABE发酵的经济效益。目前下醇价格约1.1万元/吨，丙酬0.8万元/吨， 乙醇0.55万元/吨。按照3吨糖产1吨溶剂来算，A肥发酵的产品价值只是略高于原料(约3200 元/吨糖），使得生物法生产ABE经济效益很差。然而2，3-下二醇价格较高，市场价格约10万 元/吨。因此提高A邸发酵中的2，3-下二醇产量将显著提高A邸发酵的经济效益。
[0007] (2)有利于开发W2,3-下二醇为代谢前体的其他重要化学品。ABE发酵中，下醇是 一个疏水性很强的化合物，对细胞有很大的毒性，限制了下醇的发酵效率。相比下醇，2,3-下二醇或者2-下醇对细胞的毒性较小。2，3-下二醇经脱水反应可W生产1，3-下二締，1，3-下二締可W进一步用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等，醋化产品是合成聚醋和聚氨醋 的前体。由于2,3-下二醇冰点低达-60°C，因此可W用作抗冻剂。2,3-下二醇还可W通过脱 氨反应生成双乙酷，双乙酷具有令人愉快的香味，是食品工业中一种具有高附加值的调味 剂，同时双乙酷可W抑制食物中一些微生物的生长。另外，2,3-下二醇通过脱氨反应还可W 生产甲基乙基酬，它是一种有效的燃料添加剂，燃烧值比乙醇还要高，同时甲基乙基酬还可 W用作树脂和涂料的溶剂。而2,3-下二醇本身的燃烧热值达到27198J/g，可W和其它液体 燃料如甲醇（22081J/g)和乙醇（29055J/g)相媳美，将等摩尔的乙醇和2,3-下二醇混合后， 燃烧热值可W达到27660J/g，因此，乙醇的添加并不影响2，3下二醇在燃料工业的应用。
[000引为了提高丙酬下醇梭菌2,3-下二醇的产量，研究通常先强化产生3-径基下酬的 乙酷乳酸的合成反应，而非强化乙酷乳酸脱簇反应。因为通常认为，乙酷乳酸合成反应对3-径基下酬的生成贡献更大，而即使在缺乏ALDC(乙酷乳酸脱簇酶）的情况下乙酷乳酸仍可W 自发脱簇生成3-径基下酬。然而，无论是在丙酬下醇梭菌中表达其自身的ALS(乙酷乳酸合 成酶)还是枯草芽抱杆菌的ALS，3-^基下酬产量均没有提高(Wardwe 11 ,S.A.Metabolism of acetoin in C.acetobutyli州mATCC824.Rice University.1999)。运表明丙酬下醇梭 菌中通过表达ALS来强化乙酷乳酸的合成反应对3-?基下酬产量的影响甚小。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是，提供一种联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌。
[0010] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌的 构建方法。
[0011] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌 的应用。
[0012]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0013] 联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌，它是导入了乙偶姻还原酶基因的产下醇梭 困。
[0014] 联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌，它是导入了乙酷乳酸脱簇酶基因和乙偶姻 还原酶基因的产下醇梭菌。
[0015] 其中，所述的乙酷乳酸脱簇酶基因，其核巧酸序列为SEQ ID NO: 1~7所示核巧酸 序列中的任一种，其核巧酸序列优选沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N 0:7,最优选SEQ ID N0:2。
[0016] 其中，所述的乙偶姻还原酶基因，其核巧酸序列为SEQ ID N0:8~11所示核巧酸序 列中的任一种，其核巧酸序列优选SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID ^):11，最优选56〇 ID N0:9、SEQ ID N0:11。
[0017]其中，所述产下醇梭菌为丙酬下醇梭菌（(：.日。6*〇611*711。11111)、拜氏梭菌 (C.beijerinck ii)、糖下醇梭菌（C. saccharobutylicum)、糖下醇丙酬梭菌 (C. saccharoperbutylacetonicum)、下酸梭菌（C.butyricum)、产芽抱梭菌 (C. sporogenes)、己氏梭菌(C.pasteurianum)、酪下酸梭菌(C. tyrobutyricum)、产气芙膜 梭菌（C. perfringens)或肉毒梭菌（C. botul iruim)。
[0018]其中，所述丙酬下醇梭菌为丙酬下醇梭菌ATCC 824或丙酬下醇梭菌CGMCC 5234。 W下实施例中丙酬下醇梭菌B3
[0019] 上述联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌的构建方法，从梭菌属、芽抱杆菌属、沙 雷氏菌属、肠杆菌属或克雷伯氏菌属细菌的细胞中克隆乙偶姻还原酶基因，并将其克隆到 表达载体中，构建表达乙偶姻还原酶的重组质粒，将重组质粒导入产下醇的梭菌中，即得到 联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌。
[0020] 上述联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌的构建方法，从梭菌属、芽抱杆菌属、沙 雷氏菌属、肠杆菌属或克雷伯氏菌属细菌的细胞中克隆乙酷乳酸脱簇酶基因和乙偶姻还原 酶基因，并将两种基因克隆到表达载体中，构建融合表达乙酷乳酸脱簇酶和乙偶姻还原酶 的重组质粒，并将重组质粒导入产下醇的梭菌中，即得到联产下醇与2,3-下二醇的基因工 程菌。
[0021] 优选将乙酷乳酸脱簇酶BSU36000和乙偶姻还原酶化ei_1464融合表达，最优选将 乙酷乳酸脱簇酶BSU36000和乙偶姻还原酶BSU06240之间插入如下RBS序列： AGGAGGTTAGTTAGA。
[0022] 其中，所述的表达载体为pIMPI-p忧。
[0023] 上述联产下醇与2,3-下二醇的基因工程菌在生产下醇和2,3-下二醇中的应用在 本发明的保护范围之内。
[0024] 本发明通过在产下醇梭菌中引入乙偶姻还原酶，将代谢过程中产生的3-径基下酬 (乙偶姻)进一步转化为2,3-下二醇。同时，通过强化乙酷乳酸脱簇反应来提高3-径基下酬 (乙偶姻）产量，使反映过程中生成丙酬进一步代谢生成更多的3-径基下酬（乙偶姻），进一 步在乙偶姻还原酶的作用下将乙偶姻转化为2,3-下二醇，而下醇产量不受影响，提高了梭 菌发酵的产品得率，也提高了梭菌发酵的产品价值。
[0025] 有益效果:本发明通过在丙酬下醇梭菌中强化乙酷乳酸脱簇反应，将3-径基下酬 产量由初始1.8g/L左右大幅提高到6.4g/L左右，进而在乙偶姻还原酶的作用下将乙偶姻转 化为局达8.05g/L的2,3-下二醇;而丙酬由4.5g/L左右降低至2.2g/L。显著提局了丙酬下醇 梭菌发酵的经济效益。
【附图说明】
[0026] 图1是丙酬下醇梭菌代谢网络示意图。
[0027] 图2重组丙酬下醇梭菌B3(pIMPl-BSU36000