一种拉沙热病毒核蛋白及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原检测技术领域，具体设及一种拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法及 其在拉沙热病毒核蛋白抗体检测中的应用。结果显示基因工程生产的拉沙热病毒核蛋白NP 能与相应抗体特异性的结合，NP蛋白抗原用于NP抗体的检测时具有很高的灵敏度和显著的 特异性，具有开发成为检测试剂盒的应用价值。
【背景技术】
[0002] 拉沙热病毒化assa virus, LAV)能够引起拉沙热化assa fever)急性传染疾病， 该疾病为人畜共患病，病程一般为1~4周，主要在尼日利亚、利比亚、塞拉里昂、几内亚等 西非国家中流行，美洲、欧洲也曾发现输入性病例，引起较高的发病率与死亡率。人感染拉 沙病毒后，大多数病人症状较轻，表现为发热、呕吐、腹泻、咽炎等症状，严重者出现多脏器 功能障碍、衰竭，从而导致死亡，传播能力极强。近年来，随着中国和非洲经济文化联系的日 益密切，大量人员频繁来往于中非之间，拉沙热疫情将对中国的公共卫生体系建设和拉沙 热疫情的防控带来严峻的挑战和威胁。为此，国家有关部口对此次疫情给W了高度关注，发 布了拉沙热防控的指导性文件，启动了相应的应急科技支撑项目。虽然拉沙热病毒没有在 世界范围内造成大规模流行，但是，随着经济全球化进程的深入，非洲贸易、旅游、合作、及 人员往来的增多，拉沙热病毒对各国人民的威胁与日俱增，像中国运样一个人口众多，人流 量大的国家，迫切需要对此类病毒的入侵做好储备性工作，尤其是2014年西非的埃博拉出 血热疫情的爆发，更需要特异性的检测方法能对埃博拉出血热等病毒感染和拉萨出血热感 染进行鉴别。拉沙热病毒感染的早期核酸和抗体检测技术的建立和完善是有效进行拉沙热 病毒防控的重要措施。
[0003] 血清学检测方法之中，敏感性和特异性最高的检测方法是ELISA法，可用于检测 拉沙热病毒抗原、特异性IgMJgG抗体，目前尚无商品化检测试剂盒。原核表达系统pMal-c2x是基因工程技术中重要的的表达载体，其序列中具有诱导调控原件，可W人为控制蛋白 的表达。通常MBP标签能够增大在原核表达系统中表达的融合蛋白的可溶性，提高其表达 量。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是在于提供了一种含有拉沙热病毒核蛋白NP蛋白基因的融合质粒， 该质粒表达能在细胞中能大量表达产生可溶性拉沙热病毒核蛋白NP，适合作为检测用抗 原，检测方法灵敏度强，特异性好。
[000引本发明的另一个目的是在于提供了一种拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法，该方法 简单易行，操作方便，易于生产，制备的蛋白纯度高，产量大，可溶性强，易纯化，可快速获得 较多且纯度较高的重组蛋白。
[0006]本发明的再一个目的是在于提供了一种重组基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP 在化ISA检测人群血清药物中的应用，该应用方法效果佳，检测灵敏度强，特异性好，操作简 单，设备要求低、检测周期短，有很广的应用面。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术措施： 其技术构思是：申请人将原核表达系统PMAL-C2X，通过基因工程手段，与拉沙热病毒核 蛋白NP进行重组，获得融合质粒（图1)。原核表达系统生产融合抗原，方法简单，不易污染。 成功构建的pMAkC2X-LAV-NP表达载体，可W用于制备高产量、高纯度的检测用抗原拉沙热 病毒核蛋白NP，且制备过程简单方便，检测活性高。
[0008] -种基因工程抗原拉沙热病毒核蛋白NP的制备方法，其步骤是： A、 引物设计:设计两条引物扩增拉沙热病毒核蛋白NP基因，正向引物为5'- GAA TTC ATG AGT GCC TCA AAG GAA AT -3'（F),反向引物为5'- GTC GAC TTA CAG AAC GAC TCT AGG TGT C -3'（R); B、 PCR扩增基因：用扩增引物F(正向引物)和R扩增基因（反向引物），扩增模板为合成基 因，序列已公开化eneBank accession number NC_004296)ePCR反应的试剂如下：将扣1的 lOxTaq聚合酶缓冲液、1μ1的dNTP混合物、1μ1的引物F、化1的引物R、化1的扩增模板、1μ1的 TaqDNA聚合酶和40μ1的121°C、20min灭菌后的Mi 1 iQ超纯水混合，PCR反应条件:94°C预变性 300秒、94°C变性30秒、53°C复性45秒、72°C延伸90秒、72°C最后延伸300秒，循环30次，获得 扩增带（图2)。
[0009] C、融合载体构建：0.8%(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，胶回收，与pGEM-T Easy载体（由PR0MEGA公司原产，CAT NO: A137A，请见遗传资源表)连接，测序验证序列。用 EcoR巧日Sail双酶切含NP基因的DNA片段，与同样双酶切的pMAkC2X(由肥B公司原产），4 °C 下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌3〇3日《曰(063)由齡￥曰旨日11公司原产，〔4了^):71400)。培 养菌株过夜，提取质粒，双酶切验证表明融合载体pMAkC2X-LAV-NP构建成功。
[0010] D、将步骤C获得的融合载体进行培养，挑取转化有表达载体的克隆株pMAレC2X-LAV-NP-Rosetta(DE3)至5 ml加入新鲜LB(加入50 mg/ml氨节青霉素和35 mg/ml氯霉素抑 制杂菌生长），过夜培养。
[0011] E、100 μ1培养物加至5 ml新鲜LB(加入50 mg/ml氨节青霉素和35 mg/ml氯霉素 抑制杂菌生长），37°C培养3 h，测00600=0.2~0.4。
[001引 F、加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG浓度0.03mM、诱导溫度30°C、 诱导时间地。诱导完毕，吸取1ml菌液，8,000巧m离屯、10 min,分离得到菌体。
[0013] 6、倒尽培养基残液，11111?85重悬菌体，超声波破碎细胞，00600<0.1。12,000巧111 离屯、10 min,分离溶液相与固相，SDS-PAGE验证目的蛋白有表达（图3)。使用直链淀粉树脂 纯化收集溶液相中的带有MBP-化g的目的抗原LAV-NP(图4)，获得基因工程抗原拉沙热病毒 核蛋白NP。
[0014] 将获得的克隆株Escherichia coli Rosetta (DE3)/pMAkC2X-LAV-NP在武汉大 学保藏，该菌株大肠杆菌Rosetta (DE3)/pMAkC2X-LAV-NP Escherichia coli Rosetta (DE3)/pMAl^-C2X-LAV-NP已于2015年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称 CCTCC，湖北省武汉市武昌塔挪山），保藏编号为CCTCC Μ 2015719。
[0015] 含有拉沙热病毒核蛋白NP蛋白基因的融合质粒构建过程中所述的IPTG是β-半乳 糖巧酶的活性诱导物质。基于运个特性，当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ基因载体 DNA)WlacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13隧菌体的载体DNA进行转染时，如果在平 板培养基中加入X-Ga巧PIPTG，由于β-半乳糖巧酶的α-互补性，可W根据是否呈现白色菌落 而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可W作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表 达诱导物使用。
[0016] 检测用拉沙热病毒核蛋白NP在使用western-blot、化ISA方法检测拉沙热病毒核 蛋白抗体W及该化ISA方法在人群血清样本检测中的用途，一种重组基因工程抗原拉沙热 病毒核蛋白NP在化ISA检测人群血清药物中的应用，它包括下列步骤： A. western-blot检测拉沙热病毒核蛋白NP抗体。将样品进行SDS-PAGE后，150 mA， 45min将样品转移到PDVF膜上。5%(m/v)脱脂奶粉，4 °C下封闭过夜。TBST(Tris-Buffered Saline with 0.05% Tween-20)洗涂5次，每次间隔5minD2000倍稀释阳性抗体LAV-NP作为 一抗，室溫解育1.5 hour。同样方法洗涂5次，解育2000倍稀释的带有AP标记一羊抗兔二抗 (由碧云天公司提供，CAT NO: A0258)，在室溫下解育1 hour。洗涂后，将膜加入到含有底物 BCIP(300X)10 μ1，底物NBT(150X)20山，底物工作液3 ml的染色槽中，显色约5分钟后用 无菌水终止反应。实验结果显示抗原在Western-blot试验中表现了极强的灵敏性及特异性 (图 5)。
[0017] B.化ISA检现啦沙热核蛋白NP抗体。抗原与包被液(0.05 mol/L化2C03-Na肥03缓 冲液抑9.6)充分混合，4摄氏度包被过夜，每孔加入抗原稀释液100 μ1(包被抗原浓度：1.5 μg/ml)ePBST(含0.05% tween-20)洗涂5次，注满后，静置3min，拍干。5%(质量体积)脱脂奶 粉在37摄氏度下，封闭1 hour，注满，PBST洗涂5次。兔源拉沙热核蛋白NP抗体用PBST，加入 1% (m