一种新型抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其产生菌和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵产新型抗菌脂肤，设及一种新型抗菌脂肤[ACl] Plipastatin及其产生菌和应用。
【背景技术】
[0002] 食品发酵工业、农业生产W及医药工业长期面临W下一些问题:食品的微生物污 染，植物病虫害，日益严重的致病菌抗药性。传统的解决方法(化学防腐剂、化学农药、抗生 素)虽然可W暂时缓解矛盾，然而随着检测技术的进步W及环保意识的提高，人们开始注意 到上述化学药剂的潜在危害。开发高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然防腐剂已经成为 当前食品、医药、植物抗病基因工程领域的研究和应用热点，将具有更广阔的发展空间。
[0003] 基于科技的进步，检测手段的完善W及人类对生态环境意识的提高，低毒、高效、 选择性强、残留时间短、对环境污染小的微生物天然防腐剂和生防试剂的研究和开发日益 引起国内外专家学者的关注。微生物是地球上分布最为广泛的一大类生物，它无处不在，是 一个丰富的资源宝库。细菌又作为自然界中分布最广泛的一类微生物，W其繁殖速度快、适 应能力强、易于人工培养等优势，倍受微生物工作者越来越多的关注。从微生物中提取抗菌 物质成本低、周期短、操作简单方便、容易实现工业化生产，而且微生物分泌的抗菌物质抑 菌谱较宽，热稳定性较好，适用pH范围广，使用过程不易产生抗性菌和交叉括抗性，因此可 W发挥更大的工业应用价值。
[0004] Fengycin家族的脂肤类化合物是由含有十个氨基酸的肤链与β-径基脂肪酸链(通 常C14-C18)交联形成的内醋环状结构，具有专一的抗真菌活性。研究证明化ngycin合成酶 由NRPSs Fenl-化n5五个模块构成，分别由基因 fenA-E编码。该复合酶由于分子量在十万至 百万道尔顿之间，因此分离纯化有一定难度。此外，Steller纯化和鉴定了Plipastatin合成 酶，其序列、结构和功能与fengycin合成酶十分相似。而且Plipas1:atin与fengycin合成酶 基因开放阅读框序列高度同源，研究认为Plipas化tin与fengycin为同一脂肤类物质
[0005] Plipastatin模块中都有A-,PCP-,and C-domains,modifying domains。通过运些 模块和结构域的线性排列，合成出具有10个氨基酸和β-径基脂肪酸链的环形抗菌脂肤。通 过之前Claudia Qiiocchini(2006)的报道，NRPS系统中当COM即Linker结构域供体和受体 不相容时，产物形成终止，通过COM结构域的交换实验，证实了 COM结构域对NRPS中蛋白质与 蛋白质之间的控制作用，去除COM结构域的选择障碍，可W合成不同的脂肤产品。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是针对上述技术问题提供利用溫敏型质粒PKS2同源重组构建产抗菌 脂肤[Δα ]pl ipastatin的枯草芽抱杆菌PB2-LC1。
[0007] 本发明另一个目的是提供新型抗菌脂肤[ACl]Plipastatin的发酵、分离纯化、结 构鉴定W及生物活性检测的方法。
[000引本发明的目的通过下列技术方案实现：
[0009] -株产抗菌脂肤[ACl]plipastatin的枯草芽抱杆菌PB2-LC1，该菌株通过w下步 骤构建得到：
[0010] α)PMD-19T-ΔCl重组质粒构建：W保藏编号为CGMCCN0.11723的枯草芽抱杆菌 PB2-L基因组DNA为模板，W沈QIDN0.2所示的5'ppsC-D-ΔCl(ClaI)-F和沈QIDN0.3所 示的3'ppsC-D-ACl-S0E-R为引物进行P1 ipas化tin C和D亚基基因的上游同源臂PCR扩增； W沈QIDN0.4所示的5'ppsC-D-ΔCl-S0E-F和沈QIDN0.5所示的3'ppsC-D-ΔCUKpnI)-R为引物进行下游同源臂PCR扩增;取等摩尔体积的上游和下游同源臂扩增产物作为模板进 行PCR扩增，所用的正向引物和反向引物分别为：SEQ ID N0.2所示的5/ppsC-D-ΔCl (ClaI)-F和沈QIDN0.5所示的3'ppsC-D-ΔCUKpnI)-R，获得融合的PlipastatinC和D亚 基基因上游和下游同源臂片段;将上述获得的融合的Plipas化tin C和D亚基基因上游和下 游同源臂片段与PMD-19T载体链接，连接产物转化Escherichia coli D册α，挑取单菌落，接 种于含终浓度为lOOmg/mL氨节霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，菌液经PCR扩增，筛 选阳性克隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，W及测序，得到含有Plipas化tin C和D亚基基因 上游和下游同源臂的PMD-19T-AC1质粒；
[0011] (2)将溫敏型质粒地S2和PMD-19T-AC1质粒分别用Clal和ΚρηΙ双酶切，连接地S2 酶切后的大片段和PMD-19T-AC1质粒酶切后的小片段，连接产物转化Escherichia coli D册α，得到阳性转化子，成功构建融合质粒地S2-AC1;
[0012](3)将构建好的融合质粒地52-么(：1转化保藏编号为〔610：^).11723的枯草芽抱 杆菌？82-1^菌株，^沈9 10側.6所示的5'?1(5-1058斗觀斗和569 10側.75'?1(5-1058斗觀-R为引物PCR扩增，验证得到的阳性转化子，通过同源重组的方法整合到B. subti 1 iS PB2-L 菌株的基因组上获得产抗菌脂肤[ACl]plipastatin的枯草芽抱杆菌PB2-LC1。
[0013] 本发明所述的枯草芽抱杆菌PB2-LC1在产抗菌脂肤[ACl]plipastatin中的应用。
[0014] 利用枯草芽抱杆菌(B. subtilis)PB2-LCl菌株制备抗菌脂肤[ACl]plipastatin 的方法，包括下列步骤：
[0015] a.将枯草芽抱杆菌(B.subtilis)PB2-LCl进行培养，得到抗菌物质发酵液；
[0016] b.抗菌物质发酵液离屯、，收集上清液，酸沉，将沉淀进行甲醇抽提，得抗菌提取物；
[0017] C.抗菌提取物通过HPLC分离纯化[ACl ]Plipastatin。
[0018] 进一步，所述的方法优选包括下列步骤：
[0019] a.枯草芽抱杆菌 PB2-LC1 产[ACl]Plipastatin 的发酵
[0020] 将枯草芽抱杆菌PB2-LC1接种于试管斜面营养琼脂培养基上，37°C培养2地，将菌 种活化；再将试管斜面活化的枯草芽抱杆菌PB2-LC1菌种接种于LB液体培养基，37°C、 18化pm培养20~2地，至对数生长期，制成浓度为10 7~108c化/1的种子液;将枯草芽抱杆菌 PB2-LC1种子液W3-5%浓度接种于Landy发酵培养基中，在33°C和ISOrpm条件下培养72h， 得到抗菌物质发酵液；
[0021] b.枯草芽抱杆菌PB2-LC1产[Δα ]Plipastatin的分离
[0022] ①取上述发酵液在5000r/min下离屯、25min除去菌体，上清液调pH至2.0,低溫过 夜，500化/min离屯、20min取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力揽拌器上低溫揽拌化， lOOOOr/min离屯、20min后得到的上清液即为[ACl]Plipastatin粗提物；
[0023] ②枯草芽抱杆菌PB2-LC1产抗菌物质高效液相色谱分析（HPLC):将[ACl] plipastatin提取物采用RP-C"柱（4.6mmΦX250mm)进行肿LC分离纯化[ΔCl] p 1 i pas tat in;洗脱液为均含有1 %〇Ξ氣乙酸的水(A)和乙腊(B)溶液(Ξ氣乙酸和乙腊为 MERK公司产品），梯度洗脱条件为：0~10min，B 5%;10~60min，B 95%;流速为0.80ml/ min;检测波长为214nm;[ACl]Plipastatin的HPLC洗脱保留时间分别约为31~35min;
[0024] C.枯草芽抱杆菌PB2-LC1产抗菌物质的鉴定
[0025] 枯草芽抱杆菌PB2-LC1抗菌提取物经HPLC分离后，各抗菌组分再利用电喷雾电离、 诱导石並撞角军离质谱（Electrospray ioniz曰tion m曰ss spectrometry/collision-induced dissociation，ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。
[00%] 所述的方法，其中步骤b中高效液相色谱仪为美国AGILENT llOOseries，配备DVD 检测器。
[0027]所述的方法，采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱仪化C-FTICR-MS)测定样品的分子量进行分析，液相色谱条件中流动相成分和比例与HPLC中的相同，梯度 洗脱条件为:0-20min，B 5-95 % ; 20-22min，B 95-100 %，流速为0.2ml/min;电喷雾源操作 电压为5kV，操作溫度为300°C，操作压力为20abr。
[00%]本发明利用枯草芽抱杆菌PB2-LC1生产的抗菌物质[ACl]Plipastatin:来自枯草 芽抱杆菌(B.subtilis)PB2-LCl，是一系列线性抗菌脂肤类化合物的总称，共有7种组分，经 过 LC-FTICR-MS 鉴定分子量，分别为：980、994、1008、1022、1036、1050和10640曰。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] [ACl]Plipastatin是一类新型Plipastatin类抗菌脂肤的总称，对大肠杆菌、藤 黄微球菌、点青霉和桃软腐病菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害。此种抗菌脂肤是通 过人工定向改造，产生的新型抗菌脂肤，在世界范围内还没有报道。
[0031] 本发明采用的B.subtilis是被美国环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一， 我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种，并在农业领域已得到广泛的应用。枯草 芽抱杆菌PB2-LC1抗菌脂肤[ACl]Plipastatin抗菌脂肤属于人工改造微生物天然抗菌肤， 对人类健康和食品安全性高，不会导致对环境的污染，可用于生物防治、食品加工和农产品 胆藏保